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蛋白質工学によるc-myc遺伝子産物の構造と機能の研究

蛋白质工程研究c-myc基因产物的结构与功能

基本信息

批准号：
63015051
负责人：
上杉晴一
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、c-myc遺伝子産物である蛋白質(439アミノ酸残基より成る)のうち、特にDNA結合に関与すると推定されるC末端領域(178アミノ酸)を大腸菌を用いて大量調製し、その構造とDNAとの相互作用を調べることである。1.種々の発現系の検討c-myc遺伝子は3つのエクソンから構成され、蛋白質の構想遺伝子はエクソン2および3に存在する。このエクソン3部分に対応する蛋白質の発現を目指して、trpプロモーターを利用し、直接発現、融合蛋白質としての発現、菌体外分泌法により直接発現の3種の系を検討した。直接発現には、我々の教室で開発したヒト成長ホルモン用のプラスミドを用いた。融合蛋白質法では、ヒト成長ホルモンの一部をN末端側にもち、連結部にα-トロンビンによる切断配列をもつペプチド断片をそう入した融合蛋白質を設計した。分泌法では、アルカリホスファターゼのシグナルペプチドをN末端に連結した蛋白質を設計した。これらの系における発現を試みた結果、分泌法が最も有望であった。2.菌体外分泌系によるc-myc蛋白質(262-439)の調整まず野性型のアルカリホスファクターゼのシグナル配列を利用した、系を調べると、シグナルペプチドの切断が起こっていないと思われる蛋白質が主生成物であった。そこで、シグナル配列の疏水性アミノ酸領域を9個のロイシンの連続配列で置き換えた変異体シグナルを利用すると、目的の蛋白質が、全蛋白質の5%程度生産された。しかし、このものはペリプラズム中に分泌されるものの水に難溶らしく、不溶性画分に回収された。7M尿素を加えて可溶化し、ヘパリン-セファデックスのカラムクロマトグラフィーを行い精製した。今後、この蛋白質のDNAとの結合能を調べる予定である。

The purpose of this study is to modulate the interaction of c-myc gene products with protein (439 amino acid residues), especially DNA binding, and putative C-terminal domain (178 amino acid residues). 1. The development system of c-myc gene is composed of three different genes, and the protein gene is composed of two different genes. Three systems of protein development in three parts of the system, namely, utilization, direct development, fusion protein development, and direct development by in vitro secretion, were discussed. Direct discovery of the classroom development process for the development of new applications Fusion protein method: one part of the fusion protein is N-terminal, the other part of the fusion protein is α-terminal, the other part of the fusion protein is N-terminal, the other part of the fusion protein is α-terminal. Secretion method: N-terminal protein design The results of this trial are expected to be revealed by the secretion method. 2. In vitro regulation of c-myc protein (262-439) in the secretion system of bacteria shows that the wild type of c-myc protein (262- 439) can be used as the main protein product. The hydrophobic acid domain of the target protein is produced at a level of 5% of the total protein. The water soluble and insoluble components are recovered in the medium. 7M urea is added to the solution, and the solution is refined. In the future, the binding energy of protein and DNA will be regulated.