ネコ免疫不全ウイルスのエンベロープ蛋白とネコCD4蛋白との相互作用の解析

猫免疫缺陷病毒包膜蛋白与猫CD4蛋白的相互作用分析

• 批准号: 05760236
• 负责人: 森川 茂
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: 国立予防衛生研究所
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760236/
• 关键词: ネコ免疫不全ウイルス; レンチウイルス; レトロウイルス; レセプター; CD4

ネコ免疫不全ウイルス(FIV)は、HIV/SIV同様、T4リンパ球、マクロファージに感染する。このことは、ネコCD4(fCD4)がFIVのレセプターである可能性を示唆する。そこで、fCD4遺伝子をバキュロウイルス系で発現し、FIVのEnv蛋白とのinteractionの解析および精製fCD4蛋白によるFIV感染阻止実験を行い、この可能性を検証した。fCD4cDNAクローンpFT121のSmaI/ScaI fragment(2.1kbp)を含む組み換えバキュロウイルスAcFCD4およびAcFCD4transmembrane領域以下を欠失した組み換えバキュロウイルスAcFCD4T(-)を作成した。MoAbを用いた間接蛍光抗体法によりAcFCD4感染細胞表面に組み換えfCD4蛋白が検出され、免疫沈降法により60KDaの蛋白が検出された。また、AcFCD4T(-)感染細胞には、55KDaの蛋白(s-fCD4蛋白)が検出され、効率よく培養上清に分泌された。これらの組み換えfCD4蛋白とFIV Env蛋白のinteraction を解析するため、バキュロウイルスベクターで発現したFIV Env蛋白およびFIV SU蛋白とのco-immunoprecipitationを行った。その結果、fCD4蛋白とFIV Env蛋白とのaffinityは、検出されなかった。同様の実験系で、ヒトCD4とHIV Envとのaffinityは容易に検出された。さらに、s-fCD4蛋白を用いたFIV感染中和試験を行うため、AcFCD4T(-)感染細胞培養上清から、陰イオン交換クロマトグラフィー(Mono-Q,Pharmacia)のflow through画分を、陽イオン交換クロマトグラフィー(Mono-S,Pharmacia; 0-1M NaCl,10mMphosphate buffer pH6.0で溶出)により分画し、s-fCD4陽性画分をゲルろ過(Superose HR12,Pharmacia)により分画した。陽性画分をさらにMono-Sクロマトグラフィー(NaCl濃度を0.2Mよりステップグラジエントにより溶出)により分画し、0.25M NaCl溶出でs-fCD4をsingle peakとして精製した。精製s-fCD4をSDS-PAGE/CBB-R染色により解析した結果、単一バンドとして染色された。この精製s-fCD4を用いたFIV(Petaluma,TM2株)感染中和試験を行ったところ、20mug/mlのs-fCD4でも、両株とも感染中和は全く認められなかった。また、抗fCD4ウサギ抗体によるFIV感染阻止実験でも、感染阻止能は認められなかった。以上の実験成績から、FIVは、近縁ウイルスであるHIV/SIVとは異なりfCD4蛋白を感染時のprimary receptorとして利用しないことが強く示唆され、fCD4蛋白以外のレセプターを利用していることが強く示唆される。またFIVは株によりfCD4(-)のCRFK細胞に感受性を示すものと示さないものがあるが、この差異が異なるレセプターを利用するためか、それ以外の増殖過程での違いによるのかは、今後の課題である。

HIV/AIDS, HIV/AIDS The possibility of FIV's conversion to CD4(fCD4) is demonstrated. FCD4 protein analysis and interaction analysis of FIV Env protein and purification of fCD4 protein to prevent FIV infection. The SmaI/ScaI fragment(2.1kbp) of fCD4 cDNA library pFT121 is composed of the following components: AcFCD4, AcFCD4 and AcFCD4 transmembrane domain. MoAb was detected by indirect light antibody assay and immunosedimentation assay. AcFCD4 T(-)-infected cells expressed 55KDa protein (s-fCD4 protein) and secreted it in culture supernatant. The analysis of FIV Env protein interaction between FCD4 protein and FIV SU protein was carried out. FCD4 protein and FIV Env protein are the main protein in the protein chain. In the same way, CD4 and HIV affinity are easy to detect. In addition, s-fCD4 protein was detected by FIV infection and neutralization assay, AcFCD4 T(-) infected cell culture supernatant, negative exchange rate (Mono-Q,Pharmacia) flow through analysis, positive exchange rate (Mono-S,Pharmacia; 0-1M NaCl,10 mM phosphate buffer pH6.0 dissolution) analysis, s-fCD4 positive analysis (Superose HR12,Pharmacia) analysis. The positive fraction is Mono-S (NaCl concentration: 0.2M), the positive fraction is 0.25M NaCl, and the positive fraction is 0.25M NaCl. SDS-PAGE/CBB-R staining of purified s-fCD4 resulted in analysis and simple staining. The purified s-fCD4 was used in FIV(Petaluma,TM2 strains) infection and neutralization test, 20 ug/ml s-fCD4, TM 2 strains infection and neutralization test. Anti-fCD4 antibodies prevent infection with FIV. The above results show that FIV is not the same as HIV/SIV, but the primary receptor of fCD4 protein is used to express HIV/SIV. The sensitivity of CRFK cells in FIV plants is demonstrated by the differences in the use of FIV and the proliferation process.

项目成果

S.MORIKAWA,et al.: "Expression of feline CD4 antigen in insect cells by baculovirus expression vector: A lack of evidence that feline CD4 interacts to FIV envelope pruotein." (発表予定).

S.MORIKAWA 等人：“杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达猫科动物 CD4 抗原：缺乏证据表明猫科动物 CD4 与 FIV 包膜蛋白相互作用”（待提交）。