透析患者に認められる腹膜中皮細胞障害物質に関する研究

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交付申請書に記載した研究実施計画に基いて実験をおこなった。1.腹膜中皮細胞の培養系の確立カテーテル挿入時にヒトの腹膜採取を試みたが、十分な面積の壁側腹膜は採取できなかった。壁側腹膜を大きく採取すると腹壁ヘルニアの合併頻度が増加する事が予測されたため以後行わず、また臓側腹膜は開腹術に至る原因疾患が様々で同一条件の腹膜とは言い難くヒト腹膜の採取は中止せざるを得なかった。よって腹膜中皮細胞はラットより採取した。ラットの壁側腹膜を腹壁と一魂にして採取した。腹膜中皮細胞の分離には当初、申請書に記載した0.05%Tripsin-0.02%EDTAを使用したが線維芽細胞の混入が非常に多く認められたためcollagenaseに変更した。37℃45分のincubate後、表面を軽く擦過し、腹膜中皮細胞を分離した。培養液もDMEMに変更し、10%FCSを加え培養した。従来の報告から、敷石状の形態を示し抗サイトケラチン抗体陽性,FactorVIII陰性のものを腹膜中皮細胞と同定した。約10日から14日で継代可能となり、2継代目の細胞を1cell/wellとなるようにして96wellの培養容器におき、クローン化した。実験には3継代目を使用した。2.ホモシステインの腹膜中皮細胞に対する細胞毒性の検討最終濃度3mmol/l、1.5mmol/l、0.5mmol/l、0.25mmol/lのホモシステインの溶液を培養液中に添加した。細胞障害性は培養上清中へのLDHの放出量の測定で、細胞増殖抑制は【H^3】thymidine uptake で判定した。培養36時間後のLDH放出量は低濃度の0.25mmol/lと比較して各濃度で有意に増加した(P<0.05)。培養72時間後の【H^3】thymidine uptake は、にコントロールと比較して有意な増殖活性の低下を認めた(P<0.05)。特に3mmol/lの濃度では増殖活性は著しく低下していた。以上から、ホモシステインは腹膜中皮細胞を障害し、かつ増殖抑制効果も示した。よってCAPD患者における高ホモシステイン血症は腹膜機能に何らかの悪影響を及ぼすと推測された。