イムノアフィニティークロマトグラフィーを用いる活性型ビタミンD_3分析法の開発

免疫亲和色谱法活性维生素D_3分析方法的开发

• 批准号: 05771953
• 负责人: 小林 典裕
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05771953/
• 关键词: ビタミンD; 活性型ビタミンD_3; イムノアフィニティークロマトグラフィー; 抗体; ラジオレセプターアッセイ

【目的】活性型ビタミンD_3〔1,25(OH)_2D_3〕の血中レベルは、ビタミンD代謝異常を伴う各種疾患の診断指標として重要である。従来その測定は、主にニワトリ小腸あるいは受精卵十二指腸レセプターを用いるラジオレセプターアッセイ(RRA)により行われてきた。しかし、HPLCを含む多段階のクリーンアップ操作が不可欠で検体処理能力に難がある。この問題を解決するために、"タンデム"イムノアフィニティークロマトグラフィー(IAC)を新規な前処理法として開発し、そのヒト血漿RRAにおける有用性を検討した。【実験・結果】11alpha-Hemiglutaryloxy-25(OH)D_3(1)又は25(OH)D_33-hemisuccinate(2)をハプテンとして得られた抗体を不溶化し,選択性の異なるイムノカラム2種(1及び2)を調製した。ヒト血漿のエーテル抽出物をカラム1にアプライし,25%MeCN溶出画分をカラム2に適用した。20%アセトンで洗浄後,95%MeOHで吸着物を溶出し,本画分における1,25(OH)_2D_3,D_3,25(OH)D_3,24,25(OH)_2D_3の回収率を求めた。その結果,それぞれ68,0.6,2.6,1.1%の値が得られ,本IACが十分な選択性を有することが示された。そこで,健常人血漿を本IACで前処理したのち十二指腸レセプターを用いるRRAに付したところ,従来の報告と符合する値(33.5±8.9pg/ml)が得られた。また,添加回収,段階希釈などの試験結果も良好で,本IAC/RRA法の信頼性が確認された。さらに,慢性腎不全患者血漿についても良好な測定値が得られ,本症の鑑別診断に有用なことが確認された。【考察】今回開発した"タンデム"IACの導入により,HPLCの不必要な1,25(0H)_2D_3のRRAを開発することができた。本IACは精製効率と検体処理能力に優れ,RIA,GC-MSによる1,25(0H)_2D_3分析法の開発にも有用と期待される。

[Objective] To investigate the diagnostic value of active type D_3 [1,25(OH)_2D_3] in patients with various diseases. In the future, the determination of the main content of the small intestine, the use of the main content of the duodenum, the use of the main content of the RRA. HPLC contains multi-stage operation, which makes it difficult to process the system. The problem is solved by the new method of pretreatment, and the usefulness of plasma RRA is discussed. 11alpha-Hemiglutaryloxy-25(OH)D_3(1) and 25(OH)D_33-hemihydrate (2) were selected to modulate the antibody insolubilization. Plasma extract: 1. Dissolution of 25% MeCN: 2. After washing with 20% MeOH, 95% MeOH can dissolve the sorbates. The recovery rate of 1,25(OH)_2D_3,D_3,25(OH)D_3,24,25(OH)_2D_3 is calculated. The results were 68, 0.6, 2.6 and 1.1% respectively, indicating that the IAC was highly selective. In addition, healthy human plasma was treated with RRA prior to IAC, and the reported value (33.5±8.9pg/ml) was obtained. The reliability of this IAC/RRA method is confirmed by adding a review, and the test results of the segment are good. In addition, plasma samples from patients with chronic renal insufficiency were well measured and useful for differential diagnosis of the disease. [Investigation] The introduction of IAC,HPLC and unnecessary RRA were developed. This IAC has excellent purification efficiency and solvent handling capability, and the development of RIA,GC-MS and 1,25(0H)_2D_3 analytical methods is expected to be useful.

项目成果

Norihiro Kobayashi: "Syntheses of novel 25-hydroxyvitamin D_3 haptens having chemical bridges at the C1-1alpha position" J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1. 31-37 (1993)

Norihiro Kobayashi：“在 C1-1α 位置具有化学桥的新型 25-羟基维生素 D_3 半抗原的合成”J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1。

Norihiro Kobayashi: "Enzyme immunoassay for plasma 25-hydroxyvitamin D_3 employing immunoaffinity chromatography as a pretreatment method" J.Steroid Biochem.Mol.Biol.44. 93-100 (1993)

Norihiro Kobayashi：“采用免疫亲和层析作为预处理方法对血浆 25-羟基维生素 D_3 进行酶免疫测定”J.Steroid Biochem.Mol.Biol.44。

Norihiro Kobayashi: "Specificity of the polyclonal antibodies raised against a novel 25-hydroxyvitamin D_3-bovine serum albumin conjugate linked through the C-11alpha position" J.Steroid Biochem.Mol.Biol.(in press).

Norihiro Kobayashi：“针对通过 C-11α 位点连接的新型 25-羟基维生素 D_3-牛血清白蛋白缀合物产生的多克隆抗体的特异性”J.Steroid Biochem.Mol.Biol.（出版中）。

Norihiro KOBAYASHI: "Production and specificity of antisera raised against 25‐hydroxyvitamin D_3‐[C‐3]‐bovine serum albumin conjugates" Steroids. 57. 488-493 (1992)

Norihiro KOBAYASHI：“抗 25-羟基维生素 D_3-[C-3]-牛血清白蛋白缀合物的抗血清的生产和特异性”类固醇 57. 488-493 (1992)。

Norihiro Kobayashi: "Evaluation of solubilizing agents for 25-hydroxy-vitamin D_3 immunoassays" Clin.Chim.Acta. 209. 83-88 (1992)

Norihiro Kobayashi：“25-羟基维生素 D_3 免疫测定增溶剂的评估”Clin.Chim.Acta。