semi‐intact cellを用いたジフテリア毒素のエンドソーム膜通過の解析

使用半完整细胞分析白喉毒素的内体膜通道

• 批准号: 05780468
• 负责人: 馬田 敏幸
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780468/
• 关键词: semi‐intact cell; ジフテリア毒素; theta-toxin; トランスローケーション

ジフテリア毒素(DT)はエンドサイトーシスによってエンドソームに取り込まれた後、エンドソーム膜を通過して細胞質に至る。これまでDTの膜通過の研究はリポソームや細胞膜を直接通過させるなどの人工的な条件で調べられており、エンドソームから細胞質へのトランスローケーションを直接調べた研究はない。そこで私達はC.perfringens theta-toxinを用いたcell permeabilization法を開発し、これを用いてDTのエンドソームから細胞質へのトランスローケーションを調べる実験系の構築を試みた。theta-toxinはコレステロール含有細胞膜に結合し、膜にタンパク質が通過しうるサイズの穴を開ける。ヨード125でラベルしたDTを取り込ませたDTリセプター高発現細胞をプロナーゼ処理して細胞表面のDTを取り除いた。次に4℃でtheta-toxinを結合させ、未結合のtheta-toxinは血清で中和した後37℃でインキュベートして細胞膜をpermeabilizeした。細胞質中にトランスローケ-トしたAフラグメントはこの処理によって遠心上清に回収した。この実験系ではエンドソーム膜を傷つけることなく細胞膜のみに穴を開けることが必要であり、そのためのコントロールとしてはヨード125でラベルしたEGFを用いて同様に実験した。その結果、1000u/mlのtheta-toxinはAフラグメントが通過可能な穴を細胞膜に開けることができた。さらに未結合のtheta-toxinの中和のための血清濃度を検討したところ3%以上の血清濃度の時、遠心上清に現れるEGFの量がtheta-toxin処理なしの時と同程度になり、Aフラグメントの出現量も減少した。したがって、血清濃度3%の時theta-toxin処理によるエンドソーム膜のダメ-ジはないと考えられ、遠心上清中のAフラグメントは細胞質へトランスローケ-トしたもののみが検出されていると考えられる。現在、上述の条件でcell permeabilizationを行い、DTのミュータントを使ってAフラグメントのトランスローケーションにおけるDT分子の各領域の役割を解析中である。

After the DT was collected, the membrane was passed through the cell to the cell. The membrane of the DT was studied directly through the artificial conditions of the cell membrane. The artificial conditions of the cell membrane were measured directly. You can use the cell permeabilization method to open the C.perfringens theta-toxin, and then use the DT method to make sure that you don't know how to do it. There is a membrane binding enzyme in the theta-toxin cell cycle, and the membrane membrane is opened through the opening of a hole in the cell. In the DT section, the cell surface is DT and the cell surface is DT. After 4 ℃ theta-toxin, the serum of theta-toxin was neutralized and the cell membrane was permeabilize at 37 ℃ after incubation. In the cell, you don't know what to do. You don't know what to do. This is the first time that the membrane is used. The cell membrane is closed and the cell membrane is opened. The necessary information is not available. The EGF is used in the same way as in the same way. According to the results of the experiment, 1000u/ mltaltheta-toxin A was successfully activated through the membrane of the cell membrane of the possible acupoint. When the serum concentration of theta-toxin was not combined with the serum concentration of EGF, when the serum concentration of EGF was higher than 3%, the concentration of EGF was detected in the supernatant of the heart, and the concentration of EGF in the supernatant of the heart was significantly lower than that in the control group, while the concentration of EGF in the supernatant was significantly lower than that in the control group. When the concentration of serum was 3%, the theta-toxin was tested, the membrane was tested, the supernatant of the heart was supernatant, and the cells were not affected. At present, the above-mentioned conditional cell permeabilization lines, DT conditions are in the process of analysis in all fields of service cutting in various fields.