semi‐intact cellを用いたジフテリア毒素のエンドソーム膜通過の解析

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ジフテリア毒素(DT)はエンドサイトーシスによってエンドソームに取り込まれた後、エンドソーム膜を通過して細胞質に至る。これまでDTの膜通過の研究はリポソームや細胞膜を直接通過させるなどの人工的な条件で調べられており、エンドソームから細胞質へのトランスローケーションを直接調べた研究はない。そこで私達はC.perfringens theta-toxinを用いたcell permeabilization法を開発し、これを用いてDTのエンドソームから細胞質へのトランスローケーションを調べる実験系の構築を試みた。theta-toxinはコレステロール含有細胞膜に結合し、膜にタンパク質が通過しうるサイズの穴を開ける。ヨード125でラベルしたDTを取り込ませたDTリセプター高発現細胞をプロナーゼ処理して細胞表面のDTを取り除いた。次に4℃でtheta-toxinを結合させ、未結合のtheta-toxinは血清で中和した後37℃でインキュベートして細胞膜をpermeabilizeした。細胞質中にトランスローケ-トしたAフラグメントはこの処理によって遠心上清に回収した。この実験系ではエンドソーム膜を傷つけることなく細胞膜のみに穴を開けることが必要であり、そのためのコントロールとしてはヨード125でラベルしたEGFを用いて同様に実験した。その結果、1000u/mlのtheta-toxinはAフラグメントが通過可能な穴を細胞膜に開けることができた。さらに未結合のtheta-toxinの中和のための血清濃度を検討したところ3%以上の血清濃度の時、遠心上清に現れるEGFの量がtheta-toxin処理なしの時と同程度になり、Aフラグメントの出現量も減少した。したがって、血清濃度3%の時theta-toxin処理によるエンドソーム膜のダメ-ジはないと考えられ、遠心上清中のAフラグメントは細胞質へトランスローケ-トしたもののみが検出されていると考えられる。現在、上述の条件でcell permeabilizationを行い、DTのミュータントを使ってAフラグメントのトランスローケーションにおけるDT分子の各領域の役割を解析中である。