キメラ抗体を用いたバイオセンサーに関する蛋白質工学的研究

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1.単価抗原によって二量体を形成し活性化される酵素のモデルとして、抗原としてハプテンNP(4ヒドロキシ3ニトフェニル酢酸)を認識する抗体の、H鎖可変部(V_H)あるいはL鎖可変部(V_L)に、スペーサーとしてlgMのCH3およびCH4ドメインをつなぎ、そのC末にヒト上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)の膜貫通部および細胞質部を結合させたキメラ酵素をサルCOS-1細胞で発現させて作製した(V_HMERおよびV_LMER)。V_HMER、V_LMERともに単独ではNP結合能を示さなかったが、両方を混ぜた時のみに結合能がみられ、アフィニティーカラムから溶出したのちにキナーゼ活性を検出することができた。これは抗原によりV_HとV_Lが結合し安定なFvを形成したものと考えられる。現在ライセ-ト中でV_HMERとV_LMERの混合液にNPを加えてキメラ酵素の活性が変化するかどうかを様々な実験条件で検討中である。またキメラ酵素の精製を容易にするためにV_HMERおよびV_LMERのC末にストレプトアビジンに結合能のある配列(Strep-Tag)を結合させた。これらのキメラ酵素は予想通りストレプトアビジンアフィニティーカラムに結合し、この配列が精製に有効であることが示された。現在精製したキメラ酵素についても抗原応答性を調べる実験を行っている。2.NP以外の抗原に対して抗原依存性酵素活性を示すキメラ酵素を作成するため、抗ジゴキシン抗体のV_H,V_LおよびscFv(一本鎖抗体)をlgMCH3,CH4およびEGFRに結合させた。これらのうちscFvのキメラは抗原結合能と酵素活性を両方持ったbifunctionalな分子であることが確認された。またV_HとV_Lのキメラの酵素活性は確認されたがジゴキシン結合能は見られなかった。現在V_HとV_Lが安定に会合し抗原依存性活性を示すかどうかを検討中である。