ヒト歯肉毛細血管内皮細胞の分離・同定法の確立

人牙龈毛细血管内皮细胞分离鉴定方法的建立

• 批准号: 06772000
• 负责人: 森田 学
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06772000/
• 关键词: ヒト歯肉; 毛細血管内皮細胞; 分離

試料として、岡山大学歯学部附属病院または岡山県内歯科医院の患者20名(男性12名、女性8名、年齢19-83歳)から抜歯、および歯周外科時に切除された歯肉組織を用いた。ペニシリンG(100U/mL)、ストレプトマイシン(100μg/ml)を含むPBS(-)で試料を洗浄後、メスを用いて約3mmの小片に切断し、再び同緩衡液で洗浄した。細片した歯肉片を0.5%コラ-ゲナーゼ、1%EDTAを含む抗生物質含有MCDB107培地に37℃、1時間浸漬した。歯肉片を前述の緩衝液で3回洗浄した後、20%FBSを添加したMCDB107培地に移し、薬匙で歯肉片を擦過し、細胞を遊離させた。遊離した細胞を遠心し、増殖培地9.6ml(10%FBS、75μg/mL内皮細胞成長因子、30μg/mLヘパリン含有MCDB107培地)に懸濁した。この細胞をTypeIコラーゲンでコートした96ウェルプレートに、1ウェルあたり100μL分注し、5%炭酸ガス存在下37℃で培養した。コンフルエントに達した細胞のうち、単層敷石状配列を呈し、かつ、他細胞の混入が認められないウェルの細胞を、以降継代培養した。血管内皮細胞の同定は、以下の4項目で確認した。(1)単層敷石状配列;コンフルエント時の細胞を位相差顕微鏡下で観察した。(2)von Willebrand factorの存在;von Willebrand factorの存在を間接免疫抗体法により観察した。(3)Dil-Ac-LDLの取り込み;蛍光標識されたアセチル化LDLの存在を蛍光顕微鏡下で確認した。(4)血管様網目構造の形成;Matrigel上での血管様網目構造の形成を位相差顕微鏡下で観察した。なおポジティブコントロールとして、正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を、ネガティブコントロールとして、ヒト歯肉線維芽細胞を使用した。その結果、分離を試みた20例のうち、5例からヒト歯肉毛細血管内皮細胞を分離することに成功した。また、20、30歳代の患者から得られた試料では7例中3例(43%)、30、40歳代では8例中2例(25%)が分離可能であった。しかし、50歳以上の5例からは分離できなかった。

20 patients (12 males, 8 females, aged 19-83 years) from Okayama Prefectural Dental Hospital were enrolled in this study. After washing with PBS(-), cut off the sample with a small piece of about 3mm, and wash with the same buffer solution. Thin slices of meat, 0.5% EDTA, containing antibiotics, MCDB107, incubated at 37℃ for 1 hour After 3 cycles of washing, 20% FBS was added to MCDB107 culture medium, and the meat was cleaned and cells were dissociated. The free cells were suspended in 9.6ml of proliferation medium (10% FBS, 75μg/mL endothelial cell growth factor, 30μg/mL capsule containing MCDB107 medium). These cells were cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbonic acid in a 96 μL aliquot of 1 μL of TypeI Kora-Gon. The cells were cultured in vitro and in vitro. Vascular endothelial cells were identified in the same way as the following 4 items. (1)Single layer stone-like arrangement; phase difference between cells in the same layer can be observed under microscope. (2) The existence of von Willebrand factor was detected by indirect immune antibody method. (3)Dil-Ac-LDL was identified by fluorescence microscopy. (4)The formation of vascular mesh structure on Matrigel was observed under phase contrast microscope. The use of umbilical vein endothelial cells in normal umbilical vein The results showed that 20 cases were isolated successfully, and 5 cases were isolated successfully. 3 out of 7 cases (43%) and 2 out of 8 cases (25%) of patients aged 30 and 40 years old may be separated. 50 years old and above 5 cases of separation.