グルタチオン非依存型ホルムアルデヒド脱水酵素の構造と反応機構の解明

阐明谷胱甘肽非依赖性甲醛脱水酶的结构和反应机制

• 批准号: 06772137
• 负责人: 伊藤 潔
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06772137/
• 关键词: ホルムアルデヒド脱水素酵素; アルコール脱水素酵素; グルタチオン; クローニング; 部位特異的変異; システイン残基; 亜鉛

P.putida FDH(PFDH)にはグルタチオン(GSH)の代わりの機能を果たすシステイン残基が存在すると考えられる。亜鉛含有型ADHファミリーとの構造比較から、PFDHに存在する7個のシステイン残基のうち、PFDHに特有なCys-166および-257と活性中心の亜鉛に配位する可能性のあるアミノ酸残基としてAsp-169に着目し、それぞれを他のアミノ酸残基に変換した変異酵素を作製した。Cys-257のセリンへの変異体C257Sは野生型酵素と区別することができず、Cys-257は活性には関与しないことが判明した。Cys-166の変異体はいずれも不溶性となり酵素の構造維持に重要であることが分かった。Asp-169については、システイン残基への変換体D169Cにわずかながら活性が認められたことから、予想どおり活性中心亜鉛のリガンドである可能性があるが、D169AはCys-166の変異体と同様に不溶性となり明確な結論は得られていない。またクローン化した大腸菌の酵素(EFDH)の遺伝子(後述)を用いて、NAD結合領域で組み換えたキメラ酵素も不溶性であるので、現在のところ、PFDHにおいては、3番目の亜鉛リガンドとしてシステインではなくアスパラギン酸(Asp-169)が機能しており、その結果、近傍に位置するCys-166がGSHの代わりの機能を発揮するようになったのではないかという仮説を立てている。今後、より限定した領域で組み換えたキメラ酵素の構築とSH修飾試薬を用いたタンパク質レベルの解析を行っていく予定である。GSH非依存型であるPFDHの研究と並行してGSH依存型であるEFDHについて、遺伝子のクローニングを行った。高く保存されているアミノ酸配列からオリゴヌクレオチドプライマーをデザインし、PCRによって遺伝子断片を増幅した。これをプローブとして小原らの大腸菌整列クローンライブラリーからハイブリダイゼーション法によって遺伝子全体を単離した。常法によりサブクローニングし、野生株の100倍以上のFDH活性を示すクローンを作製し、大腸菌染色体上のEFDH遺伝子の位置を8.2minと決定した。

P.putida FDH (PFDH) was used to detect the presence of amino acid residues (GSH). The results showed that there were significant differences in the presence of DNA residues. There are 7 amino acid residues in PFDH, and the possibility of ligand coordination in the active center of Cys-166 is different from that of ADH. The possibility of ligand coordination is determined by acid residue assay, Asp-169 assay, and other enzyme assay. Cys-257 strain C257S wild-type enzyme was identified by enzyme activity assay, Cys-257 enzyme activity assay and enzyme assay. Cys-166 is very important for the production and maintenance of insoluble enzymes. Asp-169, D169C, D169A1Cys-166C, D169AcyCys-166C, D169A1Cys-166C, D169A1Cys-166C, D169AcyCys-166, D169AcyCys-166 In the second part of this paper, we used the enzyme of EFDH (the latter part), the combination of NAD and field system, the enzyme was insoluble, the current enzyme was not soluble, the current enzyme, the PFDH enzyme, the enzyme, the acid acid (Asp-169) were detected, the results were compared, the results were analyzed The nearby location is Cys-166 GSH. The machine is able to make sure that it is possible to make sure that you do not know what to do. In the future, you will be able to determine the level of enzymes in the field. The SH repair system will be used to determine the accuracy of the data. The GSH non-dependent EFDH PFDH study was conducted in parallel with the GSH-dependent, EFDH-dependent, non-dependent, and non-dependent. The high-level saving method is similar to that of the acid configuration, and that of the sub-fragments is different from that of the PCR. Please tell me that the whole line of bacteria is isolated from the whole body. The FDH activity of wild strains was 100 times higher than that of wild strains, and the position of EFDH particles on the chromosomes of Aspergillus spp.