ホルムアルデヒド脱水素酵素の構造と反応機構の解明

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P.putida FDH(PFDH)に存在すると考えた活性に重要なシステイン残基を同定することはできなかったが、ブチルアルデヒドを基質としたときのPFDHの反応生成物を詳しく定量的に調べた結果、dismutation反応を触媒していることが判明した。この反応において、補酵素であるNAD^+の量の変化は見かけ上観察されず、2分子のアルデヒドからアルコールとカルボン酸が生成する。PFDHはアミノ酸配列においてグルタチオン依存型FDHであるクラスIIIADHよりもクラスI型の特徴を多くもつことから、PFDHはdismutation反応を触媒するクラスI型ADHの特殊な例で、PFDHの反応は単なるホルムアルデヒドの酸化ではなくもっと複雑な反応で、アルデヒドの酸化反応に直接システイン残基が関与していないかも知れない。今後、ホルムアルデヒドを基質として反応生成物を詳しく定量的に調べて行くことが必要であると考えている。一方、大腸菌のFDH(EFDH)遺伝子(falA)をクローニングし、その塩基配列を決定したところ、falAの上流に273bpからなるORF1と非常によく保存されたプロモーターモチーフ、さらに、そのプロモーターと重なってパリンドローム構造があること、また、下流には831bpのORF2が存在することを見い出した。ORF2はヒトのホルミルグルタチオンヒドロラーゼ(SFGH)と40%のホモロジーを示し、実際ORF2を大腸菌中で過剰発現させ、SFGHの活性を測定したところ、ORF2が大腸菌のSFGHをコードしていることがわかった(falBと命名)。過剰発現させた酵素を単一に精製することにも成功した。これらの遺伝子はオペロンを形成しており、培地中にホルムアルデヒドを加えると速やかに活性が誘導されてくることも見い出した。さらに、この誘導調節にはORF1の発現と保存されたプロモーターモチーフおよびパリンドローム構造が重要であることを明らかにしつつある。