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血漿中キニノゲン欠損ラットにおけるキニノゲン分泌異常の解明

血浆激肽原缺乏大鼠中激肽原分泌异常的阐明

基本信息

批准号：
06772212
负责人：
林泉
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究においては、遺伝子的血漿中高分子キニノゲン欠損のBrown Norway Katholiek strain(B/N-Ka)ラットの肝臓における高分子キニノゲン(HK)の分泌異常の原因を明らかにすることを目的として、B/N-KaラットHK cDNAのクローニングにより推定された-アミノ酸置換(Ala(163)→Thr)の肝臓からのHKの分泌に及ぼす影響について以下の検討を行った。1.ラットHKの変異cDNAの作製およびその発現と分泌;B/N-Kaラットおよび正常ラット肝臓のcDNAライブラリーよりクローン化した正常及び異常HKcDNAを、哺乳類動物細胞用発現ベクターであるpRc/CMVに組み込み各々に対する発現プラスミドを構築した。さらにB/N-Kaラットの異常HKcDNA内で見出された487番目の一塩基置換を含んだ断片と、正常ラットcDNA内の断片をそれぞれ置き換え、〔正常型→異常型〕および〔異常型→正常型〕のHKcDNAを組み込んだ発現プラスミドもまた作製した。それぞれの発現プラスミドをCOS-l細胞にトランスフェクトし、発現させたHKの細胞からの分泌を測定した。その結果、B/N-KaラットのcDNAをトランスフェクトしたCOS-l細胞の培養上清中のHK量は、正常ラットのHKcDNAを発現したCOS-l細胞の培養上清中HK量の約10%と有意に低値を示した。さらに〔異常型→正常型〕のプラスミドでは細胞外への分泌量が有意に増加した一方、〔正常型→異常型〕のプラスミドでは発現したHKは細胞内に蓄積し、細胞外への分泌量は有意に減少した。この結果から、B/N-Kaラットの肝臓におけるHKの分泌異常は、そのcDNA内の一塩基変異による163番目のアラニンからスレオニンへの一アミノ酸置換が原因となって生じていることが判明した。2.ラットT-キニノゲンの変異cDNAの作製およびその発現と分泌;(1)の検討において明らかにしたアラニンからスレオニンへの一アミノ酸置換によって細胞からの分泌が著しく損なわれることが、HKにおいてのみ認められる現象であるのか、またはHK以外の他の分泌性蛋白質においても同様な現象が起きるのか否かについて調べた。ラットHKとは異なる遺伝子によってコードされているが、約85%の一次構造上の相同性を持ち、また163番目のアミノ酸がHKと同一のアラニンであるラットT-キニノゲン(TK)のcDNAをクローニングした。そして(1)と同様にアラニンからスレオニンへの変異を導入したcDNAをトランスフェクトした結果、TKの細胞からの分泌は有意に減少した。以上の検討から、本研究によって少なくともHKとTKについては、163番目のアミノ酸が蛋白側にとっては肝臓から血中への分泌に必須な要因の一つとなっていることが推定された。今後、アラニンからスレオニンへの置換によって、何故細胞からの分泌が損なわれるかについてさらに究明する。

The purpose of this study is to investigate the reasons for abnormal secretion of high molecular weight protein (HK) in plasma of Brown Norway Katholiek strain(B/N-Ka) and its derivatives, and to investigate the effects of B/N-Ka on abnormal secretion of HK in plasma of Brown Norway Katholiek strain and its derivatives. 1. The production, discovery and secretion of variant cDNA of Raton HK; the conversion of cDNA variants from B/N-Karaton and normal Raton liver tissues to normal and abnormal HKcDNA, and the discovery tools for each component of pRc/CMV found in mammalian cell discovery tools were constructed. A single nucleotide substitution of 487 amino acids was found in the abnormal HK cDNA of B/N-type, and fragments in the normal HK cDNA were also found in the abnormal HK cDNA. The secretion of COS-l cells and HK cells was measured. As a result, the amount of HK in culture supernatant of COS-l cells was about 10% higher than that of HK cDNA in culture supernatant of COS-l cells. In addition, the secretion of extracellular protein in HK cells from abnormal type to normal type was increased intentionally, and that in HK cells from normal type to abnormal type was decreased intentionally. As a result, the abnormal secretion of HK in B/N-Ka receptor and the abnormal secretion of HK in cDNA were identified. 2. The production and secretion of different cDNA in T-7 cells;(1) The production and secretion of different cDNA in T-7 cells;(2) The production and secretion of different cDNA in T-7 cells;(3) The production and secretion of different cDNA in T-7 cells;(4) The production and secretion of different cDNA in T-7 cells;(5) The production and secretion of different cDNA in T-7 cells;(6) The production and secretion of different cDNA in T-7 cells;(7) The production and secretion of different cDNA in T-7 cells;(8) The production and secretion of different cDNA in T-7 cells. About 85% of the primary structural identity of HK and TK is maintained, and 163 of them are identical to HK and TK. (1) The expression of the same gene is reduced by the expression of the same gene. In this study, the protein side of the liver and the secretion of the blood in the liver were estimated to be the main cause of the disease. In the future, we will investigate the reasons for the loss of secretion and replacement of cells.