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血漿中キニノゲン欠損ラットにおけるキニノゲン分泌異常の解明

血浆激肽原缺乏大鼠中激肽原分泌异常的阐明

基本信息

批准号：
06772212
负责人：
林泉
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究においては、遺伝子的血漿中高分子キニノゲン欠損のBrown Norway Katholiek strain(B/N-Ka)ラットの肝臓における高分子キニノゲン(HK)の分泌異常の原因を明らかにすることを目的として、B/N-KaラットHK cDNAのクローニングにより推定された-アミノ酸置換(Ala(163)→Thr)の肝臓からのHKの分泌に及ぼす影響について以下の検討を行った。1.ラットHKの変異cDNAの作製およびその発現と分泌;B/N-Kaラットおよび正常ラット肝臓のcDNAライブラリーよりクローン化した正常及び異常HKcDNAを、哺乳類動物細胞用発現ベクターであるpRc/CMVに組み込み各々に対する発現プラスミドを構築した。さらにB/N-Kaラットの異常HKcDNA内で見出された487番目の一塩基置換を含んだ断片と、正常ラットcDNA内の断片をそれぞれ置き換え、〔正常型→異常型〕および〔異常型→正常型〕のHKcDNAを組み込んだ発現プラスミドもまた作製した。それぞれの発現プラスミドをCOS-l細胞にトランスフェクトし、発現させたHKの細胞からの分泌を測定した。その結果、B/N-KaラットのcDNAをトランスフェクトしたCOS-l細胞の培養上清中のHK量は、正常ラットのHKcDNAを発現したCOS-l細胞の培養上清中HK量の約10%と有意に低値を示した。さらに〔異常型→正常型〕のプラスミドでは細胞外への分泌量が有意に増加した一方、〔正常型→異常型〕のプラスミドでは発現したHKは細胞内に蓄積し、細胞外への分泌量は有意に減少した。この結果から、B/N-Kaラットの肝臓におけるHKの分泌異常は、そのcDNA内の一塩基変異による163番目のアラニンからスレオニンへの一アミノ酸置換が原因となって生じていることが判明した。2.ラットT-キニノゲンの変異cDNAの作製およびその発現と分泌;(1)の検討において明らかにしたアラニンからスレオニンへの一アミノ酸置換によって細胞からの分泌が著しく損なわれることが、HKにおいてのみ認められる現象であるのか、またはHK以外の他の分泌性蛋白質においても同様な現象が起きるのか否かについて調べた。ラットHKとは異なる遺伝子によってコードされているが、約85%の一次構造上の相同性を持ち、また163番目のアミノ酸がHKと同一のアラニンであるラットT-キニノゲン(TK)のcDNAをクローニングした。そして(1)と同様にアラニンからスレオニンへの変異を導入したcDNAをトランスフェクトした結果、TKの細胞からの分泌は有意に減少した。以上の検討から、本研究によって少なくともHKとTKについては、163番目のアミノ酸が蛋白側にとっては肝臓から血中への分泌に必須な要因の一つとなっていることが推定された。今後、アラニンからスレオニンへの置換によって、何故細胞からの分泌が損なわれるかについてさらに究明する。

In this study, the macromolecules in the plasma of においては and 伝子 were damaged Brown Norway Katholiek strain(B/N-Ka)ラットの干臓におけるpolymer キニノゲン(HK )のThe cause of abnormal secretion を明らかにすることをpurpose として、B/N-KaラットHK cDNAのクローニングにより presumed acid substitution (Ala(163) →Thr) The secretion of liver secretion and the influence of liver secretion on the following are the following. 1. ラットHK's heterogeneous cDNA production and production; B/N- KARAットおよびNormal DNA reagent Transformation of normal and abnormal HKcDNA, mammalian cells using 癙クターであるpRc/CMVに组み込みeach々に対する発出账プラスミドをconstructedした.さらにB/N-KaラットのAbnormal HKcDNA でSee された487 item の一婩substituted をcontaining んだfragment と, normal ラットcDNA の片をそれぞれSETきchangeえ、〔Normal type→Abnormal type〕および〔Abnormal type→Normal type〕のHKcDNAを组み込んだ発existingプラスミドもまたproducedした.それぞれの発成プラスミドをCOS-l cell にトランスフェクトし, 発行させたHKのcell からのsecretion measurementした. The result, the amount of HK in the culture supernatant of B/N-KaldoncDNA cDNA スフェクトしたCOS-l cells Normally, the amount of HK in the culture supernatant of COS-1 cells is approximately 10%, which is an intentionally low value.さらに〔Abnormal type→Normal type〕のプラスミドではExtracellular へのsecretion amountがIntentionalにincrease plusしたone side,〔Normal type→ The abnormal type of のプラスミドでは発 is caused by the accumulation in the cells and the secretion amount outside the cells, which is intentionally reduced.このRESULTS から、B/N-KaラットのLiver 臓におけるHKのsecretion abnormality は、そのcDNA intra-cDNA 塩塩剉isoによる163 Chapter No. のアラニンからスレオニンへの一アミノAcid replacement が reason となって生じていることが clarified した. 2. Production and secretion of ラットT-キニノゲンの変differentiated cDNA; (1) Discussionにおいて明らかにしたアラニンからスレオニンへの一アミノAcid replacement によってcell からのSecretion of the secretion of なわれることが、HKにおいてのみcognitionめられるphenomenonであるのか、またはOther than HK, the secreted protein is the same as the 様なphenomenon.ラットHKとはdifferentなる伝子によってコードされているが、About 85% of the structural similarity is maintained をholdち、また163 The same のアラニンであるラットT-キニノゲン(TK)のcDNAをクローニングした.そして(1)と同様にアラニンからスレオニンへの変differentを ImportしたcDN As a result of the Adenoids, the secretion of TK cells was reduced intentionally. The above discussion, this research, the research, the research, the HK, TK, and the 163rd chapter, the sour acid It is presumed that the secretion of protein in the liver and liver is necessary because of the secretion of the protein in the blood. From now on, the アラニンからスレオニンへの replacement によって, why the cells からの secretion damage なわれるかについてさらに will be studied clearly する.