多機能性蛋白としてのキニノゲンの生体内における役割に関する研究

多功能蛋白激肽原的体内作用研究

基本信息

批准号：
07772242
负责人：
林泉
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

生理活性ペプチド、ブラディキニンの前駆体蛋白質である高分子キニノゲンの分子内には、シスタチンファミリーとの相同性を有するGln-Val-Val-Ala-Gly (QVVAG)の配列がそのH鎖内の2カ所で保持されている。一方で精製した蛋白の再構成実験では、キニノゲンがシステインプロテアーゼであるパパインと1:1の複合体を形成することによりその酵素活性を阻害することが報告されている。しかしながらH鎖上の2つのQVVAG配列のどちらが実際に機能しているかについては不明であるため、それぞれのドメインのアミノ酸を変異させたミュータントタイプのキニノゲンを作製し、in vitroでインヒビター活性を調べることによって明らかにされることが予想された。そこで本実験においては、バキュロウイルスを用いた昆虫細胞系でリコンビナントのワイルドタイプおよびミュータントタイプの高分子キニノゲンを発現させるためのベクターDNAを作製した。即ち2ヶ所のQVVAG配列を標的とし、(1) 188番目のQからAへの変異、(2) 310番目のQからAへの変異、(3) 188番目および310番目のQからAへの変異を導入するオリゴヌクレオチドを合成し、クローン化したラットの高分子キニノゲンcDNAを鋳型にして3種類のミュータントcDNAをKunkel法により作製した。そしてそれぞれのDNAについてシークエンスを行い、変異の導入を確認した。次にミュータント高分子キニノゲンcDNAをバキュロウイルストランスファー用のベクターであるpVL1393に組み込み、発現プラスミドを構築した。今後リコンビナントキニノゲンをさなぎ卵巣細胞由来Sf9細胞で発現させ精製後、システインプロテアーゼプロテアーゼに対する阻害活性をin vitroで測定する予定である。

聚合物差异是生物活性肽的前体蛋白Bradykinin，它在其H链中的两个位置都保持了与胱抑素家族具有同源性的GLN-VAL-VAL-ALA-GLY（QVVAG）的序列。另一方面，在纯化蛋白质重构的实验中，据报道，奎诺原通过与半胱氨酸蛋白酶的帕帕因形成1：1复合物，抑制其酶活性。但是，尚不清楚H链上的两个QVVAG序列中的哪一个实际上起作用，并且可以预期，通过在每个结构域中用突变的氨基酸产生突变体型激元，并在体外检查抑制剂活性。因此，在此实验中，准备使用杆状病毒在昆虫细胞系中表达重组野生型和突变类型聚合物吉尼的载体DNA。也就是说，将两个QVVAG序列靶向，并合成了从位置310到a的位置至a的突变引入突变的寡核苷酸，以及（3）从188和310到q到a的位置，并合成了三种类型的突变cDNA，并使用克隆大鼠聚合物kininogen joinegen okininogen grominogen joinegen joinegen joinenogen groment kininogen grominogen groment cdna制备。然后对每个DNA进行测序以确认突变的引入。接下来，将突变的聚合物奎诺原cDNA掺入PVL1393，杆状病毒转移的载体中，并构建了表达质粒。将来，重组奎诺原在源自菊花细胞的SF9细胞中表达并纯化，并且将在体外测量针对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。