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網膜双極細胞で代謝型グルタミン酸受容体に共役するG蛋白のクローニング

视网膜双极细胞中与代谢型谷氨酸受体偶联的 G 蛋白的克隆

基本信息

批准号：
06857129
负责人：
森樹郎
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06857129/
关键词：
G蛋白双極細胞グルタミン酸受容体

项目摘要

1)牛眼網膜から視細胞層を取り除くための層間剥離transducinαに相同なG蛋白をクローニングするため、transducinαのmRNAをなるべく含まないRNAを網膜から抽出する必要がある。フィルター紙を網膜の硝子体側から接着させてからはぎ取ることによって網膜から効率よく視細胞を取り除くことができた。残った網膜組織からRNAを抽出した。2)degenerateprimerを用いたpolymerasechainreaction(PCR)三量体G蛋白αサブユニットの塩基配列に広く保存された領域3カ所を選択してdegenerateprimerを3組設計した。1)で得られたRNAを鋳型にしてPCRを行い、増幅産物を得た。3)transducinα cDNAの除去とサブクローニングrod transducinα cDNAを消化する制限酵素で2)で得られたPCR産物を消化した後に電気泳動を行い、想定長のPCR産物のみを切り出すことでrod transducinα cDNAを除去した。このcDNAをプラスミドベクターにサブクローニングした。4)PCR産物の塩基配列決定DNAシーケンサーでサブクローニングしたPCR産物(全30種)の塩基配列を決定した。既知のG蛋白αサブユニット(Gq)が2種、cone transducinα、酵母のある酵素の相同蛋白1種、相同性のない未知の配列1種、transducin αに低い相同性をもつ未知の配列1種を得た。現在、未知の配列2種について検討を進めるとともに、全長配列を得るため、材料としたRNAよりcDNAライブラリーを作成している。

1)The expression of transducinα mRNA in the retina is necessary to extract the mRNA from the retina. The retina has a small number of neurons, and the retina has a small number of neurons. RNA extraction from the retina. 2)Degenerateprimer is used in the polymerase chain reaction (PCR) three quantities of G protein alpha protein. 1) RNA amplification 3) Removal of transducinα cDNA from the PCR product after digestion with restriction enzymes; 2) Removal of transducinα cDNA from the PCR product after digestion with restriction enzymes.このcDNAをプラスミドベクターにサブクローニングした。4) Genome alignment of PCR products determines DNA fragmentation and gene alignment of all 30 PCR products. 2 known G protein α (Gq), 1 yeast enzyme identical protein, 1 unknown sequence with identity, 1 unknown sequence with identity with low transducin α. Now, unknown and alignment 2 kinds of