古細菌由来α型耐熱性DNAポリメラーゼのX線結晶構造解析

古细菌α型耐热DNA聚合酶的X射线晶体结构分析

• 批准号: 07780599
• 负责人: 野中 孝昌
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780599/
• 关键词: DNAポリメラーゼ; X線結晶構造解析; 立体構造

宝酒造(株)バイオ研究所の石野らによりクローニングされ、大量発現の系が確立されている古細菌Pyroco ccus furiosus 由来耐熱性DNAポリメラーゼ(Pfuポリメラーゼ)の結晶化条件のスクリーニングを行った。いくつかの条件で結晶の析出が認められたが、特に、0.2M 酢酸アンモニウム、0.1M クエン酸、30%(v/v)ヘキシレングリコールの条件下で得られた結晶については、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などによる分析の結果、塩ではなくPfuポリメラーゼの結晶であることを確認した。ただし、X線結晶構造解析に耐えうる良質な結晶ではないので、現在、最適な結晶化条件の探索を行っている。一般に、蛋白質の結晶は数週間以内で析出するが、本申請のPfuポリメラーゼの結晶化には5ヶ月もの期間を要した。そのため、今の所、当初予定していた立体構造の解明には至っていない。Pfuポリメラーゼは大量発現の系が確立されているとはいうものの、X線結晶構造解析では、最終的には数百ミリグラムオーダーの試料を必要とする。そこで発現系の更なる改良を目指して、現在、条件の再検討を行っている。一方、蛋白質の結晶化の常套手段としての変異体の結晶化を目指して、変異蛋白質の発現を開始した。すなわち、酵素活性に影響を及ぼさない変異体として、N末端の数残基を削除した3種の変異Pfuポリメラーゼの発現、精製を行っている。

The crystallization conditions of Pyroco ccus furiosus, an archaeal bacterium derived from heat-resistant DNA (Pfu), were established. Under the conditions of 0.2M acetic acid, 0.1M acetic acid and 30%(v/v) acetic acid, the precipitation of crystals was observed. The results of electrokinetic analysis were confirmed. X-ray crystallographic analysis of fine quality crystals and exploration of optimum crystallization conditions Generally, protein crystallization occurs within a few weeks, but the crystallization period of the present application is 5 months. The three-dimensional structure is explained in detail. PfU has a large number of discovery systems, X-ray crystallographic analysis, and finally hundreds of samples are necessary. The improvement of the development system is aimed at improving the current situation and re-examining the conditions. A set of methods for the crystallization of proteins and heterogenous crystallizations is indicated, and the development of heterogenous proteins begins. The enzyme activity affects the development and purification of three different Pfu residues.