ラット繊維芽細胞3Y1の増殖制御におけるPKC分子種の役割

細胞内情報伝達系において重要なSer/Thrリン酸化酸素であるプロテインキナーゼC(PKC)は、多数の関連分子からなる遺伝子ファミリーを形成している。PKCは細胞の増殖や分化の制御に関わっていることが示唆されているが、その機能は分子種毎に異なっているらしい。しかし、一つの細胞には複数のPKC分子種が発現しており細胞毎にその種類や発現量が異なることから、PKCによる細胞増殖の制御機構を明らかにすることが困難になっている。そこで申請者は、transient発現系を用いて、増殖刺激依存的なDNA合成能に対するPKC高発現の効果を検討した。即ち、特定の分子種の発現ベクターをマーカー遺伝子と供に細胞に導入し静止期に同調する。これを血清等で刺激した後bromo-deoxyuridine (BrdU)によるパルスラベルを行う。マーカー及びBrdUに対する抗体を用いて二重染色し、PKCを高発現している細胞を特定しBrdUの取り込の有無を判定するものである。その結果、ラット繊維芽細胞3Y1にδ及びαを高発現させた場合、対照細胞に比べBrdU+の割合が有意に上昇し、εを高発現した場合は逆にBrdU+の減少が見られた。得に、ε高発現によるS期への移行時間が長くなる現象が見られた。各々のkinase knockout mutantを用いた場合にはこれらの効果が認められないことから、これらの現象は各々のキナーゼ活性に依存するものと考えられる。以上の結果は、3Y1細胞に発現している主たるPKC分子種であるα、δ、εが全てG0/G1期からS期へのDNA合成に至る経路に関与しているが、その作用は分子種により異なっていることを示している。

細胞内情報伝達系において重要なSer/Thrリン酸化酸素であるプロテインキナーゼC(PKC)は、多数の関連分子からなる遺伝子ファミリーを形成している。PKCは細胞の増殖や分化の制御に関わっていることが示唆されているが、その機能は分子種毎に異なっているらしい。しかし、一つの細胞には複数のPKC分子種が発現しており細胞毎にその種類や発現量が異なることから、PKCによる細胞増殖の制御機構を明らかにすることが困難になっている。そこで申請者は、transient発現系を用いて、増殖刺激依存的なDNA合成能に対するPKC高発現の効果を検討した。即ち、特定の分子種の発現ベクターをマーカー遺伝子と供に細胞に導入し静止期に同調する。これを血清等で刺激した後bromo-deoxyuridine (BrdU)によるパルスラベルを行う。マーカー及びBrdUに対する抗体を用いて二重染色し、PKCを高発現している細胞を特定しBrdUの取り込の有無を判定するものである。その結果、ラット繊維芽細胞3Y1にδ及びαを高発現させた場合、対照細胞に比べBrdU+の割合が有意に上昇し、εを高発現した場合は逆にBrdU+の減少が見られた。得に、ε高発現によるS期への移行時間が長くなる現象が見られた。各々のkinase knockout mutantを用いた場合にはこれらの効果が認められないことから、これらの現象は各々のキナーゼ活性に依存するものと考えられる。以上の結果は、3Y1細胞に発現している主たるPKC分子種であるα、δ、εが全てG0/G1期からS期へのDNA合成に至る経路に関与しているが、その作用は分子種により異なっていることを示している。