細胞増殖に関わるPKC分子種の同定とその作用機序の解析

参与细胞增殖的PKC分子种类鉴定及其作用机制分析

• 批准号: 06780586
• 负责人: 水野 恵子
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780586/
• 关键词: 細胞増殖; プロテインキナーゼC; 分子生物学; 生化学

細胞内情報伝達系において重要なSer/Thrリン酸化酵素であるプロテインキナーゼC(PKC)は、多数の関連分子からなる遺伝子ファミリーを形成している。PKCは細胞の増殖や分化の制御に関わっていることが示唆されているが、その作用は細胞によって異なる。これは細胞毎に発現しているPKC分子種の種類が異なり分子種により生理機能が異なることに起因すると思われる。G0期のラット繊維芽細胞3Y1に増殖刺激を施すと、内在性PKC分子種のうちδとεが強く活性化されるがαの活性化は検出できないことを申請者はこれまでに報告している。そこで本年度は3Y1細胞の増殖に関わるPKC分子種を同定し、その作用機序を明らかにすることを目的とし、PKCα、δ、εの高発現株を作製し増殖刺激に対する応答を解析した。即ち、PKCδ及びεの発現ベクターとネオマイシン耐性遺伝子を3Y1に導入後ネオマイシン培地で選択し、各PKC発現株を単離した。各クローンのPKC発現量は特異抗体を用いたウェスタンブロッテイング及び細胞の[^3H]PDBu結合能の測定により求めた。次に、血清飢餓により静止期に同調したPKC高発現株をTPAや血清、EGF、LPA等で刺激し、[^3H]Thymidineの取り込みを測定することにより誘導されたDNA合成量を求めた。全てのδ高発現株は内存性のδに比べ発現量が究めて低く、顕著な効果が見られなかった。しかしベクターのみを導入したコントロール株に比べ、ε高発現株ではEGF刺激に対する応答性が若干上昇していた。そこで、より高発現の効果を検討するためにtransientな発現系でDNA合成能の解析を行う系を確立した。即ち、PKCとマーカー遺伝子(CAT)を細胞に導入しマーカーに対する抗体で細胞染色によりPKCを発現した細胞を同定し、同時に細胞にBrdUを取り込ませ抗BrdU抗体による二重染色でDNA合成の有無を判定するものである。これを用い、現在εの効果について検討中である。

Intelligence 伝 in cells of department に お い て important な Ser/Thr リ ン acidification enzyme で あ る プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ C (PKC) は, most の masato even molecular か ら な る heritage 伝 son フ ァ ミ リ ー を form し て い る. PKC は cells や の raised colonization の suppression に masato わ っ て い る こ と が in stopping さ れ て い る が, そ の action は cell に よ っ て different な る. こ れ は cells in their に 発 now し て い る molecular の species with PKC が different な り molecules of に よ り physiology が different な る こ と に cause す る と think わ れ る. G0 の ラ ッ ト 繊 3 d bud cells y1 に raised colonization stimulus を shi す と, internality PKC molecular の う ち delta と epsilon が strong く activeness さ れ る が alpha の activeness は 検 out で き な い こ と を applicants は こ れ ま で に report し て い る. そ こ で の raised this year は 3 y1 cells reside に masato わ る PKC molecules of を with し, そ の function machine sequence を Ming ら か に す る こ と を purpose と し, PKC alpha, delta, epsilon の し raised the high 発 now strains を cropping colonization stimulus に す seaborne る 応 answer を parsing し た. ち, PKC delta and び epsilon の 発 now ベ ク タ ー と ネ オ マ イ シ ン patience heritage 伝 son を 3 y1 に after import ネ オ マ イ シ ン petty で sentaku し, various PKC 発 now strains を 単 from し た. Each ク ロ ー ン の PKC 発 now quantity を は specific antibody with い た ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ の び cells and [^ 3 h] PDBu binding energy の determination に よ り o め た. Time に, serum starvation に よ り telogen に homology し た PKC high 発 now strains を TPA や, serum EGF, LPA で stimulation し, [^ 3 h] Thymidine の take り 込 み を determination す る こ と に よ り induced さ れ た amount of DNA synthesis め を o た. All て の delta high 発 strains は memory now の delta に than べ 発 quantity が now investigate め て low く, 顕 な unseen fruit が see ら れ な か っ た. し か し ベ ク タ ー の み を import し た コ ン ト ロ ー に ル strain is higher than べ, epsilon 発 now strains で は EGF stimulation に す seaborne る 応 a sexual が several rising し て い た. そ こ で, よ り high 発 is の unseen fruit を beg す 検 る た め に transient な 発 で DNA synthesis can now の parsing line を を う department establish し た. ち, PKC と マ ー カ ー heritage 伝 child (CAT) を cells に import し マ ー カ ー に す seaborne る antibody で cell staining に よ り PKC を 発 now し を た cells with し, at the same time に cells に BrdU を take り 込 ま せ BrdU antibody resistance に よ る double staining で DNA synthesis の presence of を determine す る も の で あ る. Youdaoplaceholder6 れを uses れを, and now ε <s:1> results に て検 て検 て検 である.

项目成果

Akimoto,K.,et al.: "A new member of the third class in the protein kinas C family,PKCλ,expressed dominantly in an undifferentiated mouse embryonal carcinoma cell line and also in many tissues and cells." J.Biol.Chem.269. 12677-12683 (1994)

Akimoto, K. 等人：“蛋白激酶 C 家族第三类新成员 PKCλ，主要在未分化的小鼠胚胎癌细胞系以及许多组织和细胞中表达。” .269.12677-12683（1994）

Akita,Y.,et al.: "Overproduction of a Ca^<2+>-independent protein kinase C isozyme,nPKCε,increases the secretion of prolactin from thyrotropin-releasing hormone-stimulated rat pituitary GH_4C_1 cells." J.Biol.Chem.269. 4653-4660 (1994)

Akita，Y.，等人：“Ca ^ 2+ 独立蛋白激酶 C 同工酶 nPKCε 的过量产生，增加了促甲状腺激素释放激素刺激的大鼠垂体 GH_4C_1 细胞的催乳素分泌。”化学269。4653-4660（1994）

Ohno,S.,et al.,: "Activation of novel protein kinase Cδ and Cε upon mitogenic stimulation of quiescent rat 3Y1 fibroblasts." J.Biol.Chem.269. 17495-17501 (1994)

Ohno, S. 等人：“对静止大鼠 3Y1 成纤维细胞进行有丝分裂刺激时新型蛋白激酶 Cδ 和 Cε 的激活”，J.Biol.Chem.269（1994 年）。

Ikuta,T.,et al.,: "Cholesterol sulfate,a novel activator for the η isoform of protein kinase C." Cell Growth & Differentiation. 5. 943-947 (1994)

Ikuta, T. 等人：“硫酸胆固醇，蛋白激酶 C η 亚型的新型激活剂。细胞生长与分化”。

Hirano,M.,et al.,: "A protein kinase C isozyme,nPKC ε is involved in the activation of NF-κ B by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA)in rat 3Y1 fibroblasts." Biochem.Biophys.Res.Commun.206. 429-436 (1995)

Hirano, M. 等人：“蛋白激酶 C 同工酶 nPKC ε 参与大鼠 3Y1 成纤维细胞中 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯 (TPA) 的 NF-κ B 激活。”生物物理学.Res.Commun.206。429-436 (1995)