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GH_4C_1細胞におけるリソゾームシステインプロテアーゼの細胞内輸送機構について

关于溶酶体半胱氨酸蛋白酶在GH_4C_1细胞中的胞内转运机制

基本信息

批准号：
07770016
负责人：
和栗聡
金额：
$ 0.51万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)GH4C1細胞におけるMPR(mannose 6-phosphate receptor)の発現解析。CI(cation independent)およびCD(cation dependent)MPRの発現を解析するために、まずCDMPRの細胞質側領域のペプチドを合成し、これに対するポリクローナル抗体を作製した。そしてこの抗体が、免疫沈降法、蛍光抗体法に使用できることを確認した。RT-PCR、免疫沈降法、蛍光抗体法により、GH4C1細胞におけるMPRの発現を検索した結果、同細胞においてはCIMPRの発現がCDMPRに比して著しく低いことが明らかになった。そしてこのことが、私の見出した現象、すなわち同細胞においてシステインプロテアーゼがリソゾームだけでなく分泌顆粒にも局在し、細胞外へ分泌されることの説明となることが示唆された。また、内分泌系の他の培養細胞株として知られるAtT-20、PC12細胞およびラット下垂体組織にて同様の解析をした結果、PC12細胞ではGH4C1細胞とは逆にCIMPRがCDMPRより発現が強く、AtT-20細胞、ラット下垂体では両者が同程度に発現していることが確認された。このことは組織、細胞により両者の発現様式が異なることを示唆する。(2)GH4C1細胞へのMPR遺伝子導入。(1)の結果に基ずき、エレクトロポレーション法を用いてヒトCIMPR遺伝子をGH4C1細胞に遺伝子導入した。安定に発現する細胞株を得るためG418 Sulfateで選択し、蛍光抗体法にて発現を確認することにより、CIMPRを高率に発現するクローンが得られた。現在、この細胞におけるシステインプロテアーゼの局在および分泌動態の解析を行っている過程である。

(1) Analysis of MPR(mannose 6-phosphate receptor) expression in GH4C1 cells. The expression of CI(cation independent) and CD(cation dependent) is analyzed and synthesized in the cytoplasmic domain of CDMPR. The use of antibody, immunosedimentation and fluorescent antibody methods is confirmed. RT-PCR, immunoprecipitation method, fluorescent antibody method, detection of MPR in GH4C1 cells, detection of CIMPR in the same cells, and detection of CDMPR in different cells. This is a phenomenon that occurs in cells and cells that are secreted in cells. In addition, it was confirmed that the expression of CDMPR in PC12 cells was stronger than that in GH4C1 cells and in AtT-20 cells. The expression of these genes in tissues and cells is different. (2) MPR gene transfer into GH4C1 cells. (1)As a result, the gene expression of CIMPR gene was introduced into GH4C1 cells by using the gene expression method. Once a cell line was developed for stability, G418 Sulfate was selected and the development was confirmed by the fluorescent antibody method, a tool for the development of CIMPR at a high rate was obtained. Now, this cell is in the process of analyzing the secretion dynamics.