光学顕微鏡を用いたゴルジ体-エンドゾーム-細胞膜間輸送動態の定量化とその応用

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本研究では、インシュリン様成長因子2/マンノース6リン酸受容体(IGF2/M6PR)のポストゴルジ輸送、すなわちトランスゴルジネットワーク(TGN)、エンドゾーム、および細胞膜間輸送の動態を定量する方法を確立した。IGF2/M6PRと緑色蛍光蛋白(GFP)との融合蛋白(GFP-IGF2/M6PR)を細胞に発現させ、TGN領域の蛋白のみをレーザー光で消光させ、その後の同領域における蛍光の回復を測定した。この蛍光退色後回復法(FRAP法)を用いることで、GFP-IGF2/M6PRが細胞内のコンパートメント間を約40分で一巡することが分かった。また、細胞質外ドメインを欠いた融合蛋白はより短時間で一巡する傾向があることから、細胞質外ドメインの存在が正しいIGF2/M6PRの輸送に必要であることが示唆された。この結果を受けて、IGF2/M6PRの細胞質外ドメインの機能をさらに詳細に検討した。コレステロールの代謝や輸送を乱す薬物であるU18666Aを投与すると、IGF2/M6PRは細胞内の分布変化を示すが、細胞質外ドメインを欠いた変異蛋白は変化しなかった。従って、同薬剤が細胞質外ドメイン依存的な輸送経路の同定に有効であることが分かった。さらに、細胞質外ドメインのM6Pを含むリガンド群(主にリソソーム酵素)との結合部位を欠失させた変異蛋白もU18666Aの影響を受けなった。これらの結果は、IGF2/M6PRの輸送にはM6Pリガンドの結合に依存した経路が存在することを示すとともに、同経路にはコレステロールの代謝/輸送が関わることを示唆する。