アルツハイマー病βアミロイド線維重合の反応速度論的解析

阿尔茨海默病β-淀粉样原纤维聚合的动力学分析

• 批准号: 07770149
• 负责人: 内木 宏延
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: 福井医科大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770149/
• 关键词: アルツハイマー病; βアミロイド線維; チオフラビンT; 分光蛍光定量法; 一次反応速度論モデル

我々は、蛍光色素チオフラビンTを用いた分光蛍光定量法(Naiki et al.Anal.Biochem.177,244-249,1989)を応用し、βアミロイド線維定量法を確立した。(a)合成アミロイドβ/A4蛋白質(β1-40,400μM)をpH7.5,37℃で3日間インキュベートし、βアミロイド線維(f(1-40))を作成した。電子顕微鏡を用いた形態学的観察により、典型的アミロイド線維を確認した。(b)f(1-40)に結合したチオフラビンTの極大励起・蛍光波長は、各々446nm,490nmであった。(c)チオフラビンT蛍光強度は溶液のpHに依存し、pH8.5付近で極大となった。(d)10μg/mlのf(1-40)に対しチオフラビンT濃度を変化させ、蛍光強度の変化からScatchard plotを作成した。Kd値は約860nMであった。(e)5μMのチオフラビンTに対しf(1-40)濃度を変化させた場合、蛍光強度は直線的に変化し、これよりf(1-40)定量のための標準曲線を作成した。次に我々はその方法を応用し、f(1-40)の形成機構を反応速度論的に解析した。(a)f(1-40)を超音波破砕後、β1-40と37度でインキュベートし、f(1-40)の伸長を、電顕を用いた形態的観察、及び分光蛍光法によりモニターした。(b)反応会誌1時間後の電顕観察により、アミロイド線維長の増加を認めた。(c)反応開始後蛍光はラグタイム無く増加し、やがて平衡に達した。反応開始後10分間は蛍光は直線的に増加した。従って反応開始10分後の蛍光量増加を重合初速度と見なし、以下の解析を行った。(d)重合初速度はpH7.5付近で極大となり、15度から45度の間で反応温度に大きく依存した。(e)見かけの伸長初速度は、f(1-40)の数濃度が一定の場合,重合速度Kon x[C]と脱重合速度Koffの和として表された(Kon、Koff:重合、脱重合の速度常数、[C]:β1-40濃度)。以上より、f(1-40)の伸長は、一次の速度論、つまり既に存在する線維の端に、β1-40がstep by stepに結合し、立体構造を変化させることにより起こることを証明した。

We used the spectrophotometric method (Naiki et al.Anal.Biochem.177244-2491989) to determine the concentration of light, and the β-rays to determine the content of the drug. (a) the synthesis of β