自家蛍光標識レトロウイルスによる造血幹細胞マ-キング

使用自身荧光标记的逆转录病毒进行造血干细胞标记

• 批准号: 07770871
• 负责人: 久米 晃啓
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770871/
• 关键词: 造血幹細胞; レトロウイルスベクター; green fluorescent protein; 遺伝子治療

Green fluorescent protein(GFP)を用いた自家蛍光標識レトロウイルスベクターを構築するためにまず、血液細胞においてGFPを発現させるにはどのプロモータが適当か、また野生型GFPとある点突然変異を持つGFP(S65T)のどちらが強い蛍光を発するかを検討した。血液細胞にゲノムあたり1コピーのGFP遺伝子を組み込む条件下では、1.検討したプロモータのうち、retrovirus long terminal repeat promoterとcytomegalovirus early promoterによる発現は不十分だが、SRαpromoterおよびβ-actin promoterによる発現は良好である、2.野生型GFPよりS65Tの方が蛍光強度において優れている、という結果を得た。以上より、SRα-S65Tを発現カセットとしてMSCVレトロウイルスに組み込んだベクター(MSCV/SRα-S65T)を構築した。MSCV/SRα-S65TをGP^+E86パッケージング細胞にトランスフェクトして得たウイルス産生細胞集団から、GFPの蛍光を指標にセルソーターで高ウイルス力価のものを選別し得た。選別したウイルス産生細胞との共培養感染法により、マウス白血病細胞株とマウス初代骨髄細胞にそれぞれ約10%の頻度でGFPを発現させることができ、GFP発現細胞をセルソーターで分取することに成功した。分取した骨髄細胞を致死量放射線照射したマウスに注射したところ、得られた脾コロニー(CFU-S_<12>)の大部分が蛍光を発しており、MSCV/SRα-S65Tが未分化な造血幹細胞に感染して機能を発現したことが確認された。以上の結果は、GFPが造血幹細胞の標識に使用できることと、これを用いて外来遺伝子が導入された細胞だけを短期間に選別分取できることを示しており、血球分化・増殖の動態解明と遺伝子治療の研究に画期的な手段を与えるものである。

Green fluorescent protein(GFP) is used in the construction of its own fluorescent marker, in the development of GFP in blood cells, in the development of GFP, in the development of GFP, in the development of GFP in blood cells, in blood cells, in the development of GFP in blood cells, in blood cells, in the development of GFP in blood cells, in the development of GFP in blood cells, in blood cells 1. Detection of GFP gene in blood cells was not very good, SRαpromoter and β-actin promoter were not very good, 2. Wild-type GFP gene S65 was very good, and the results were obtained. The structure of MSCV/SRα-S65T was developed based on the above structure and SRα-S65T. MSCV/SRα-S65T GP^+E86 The co-culture infection method for the selection of GFP-producing cells and leukemia cell lines was successful in isolating GFP-producing cells with a frequency of about 10%. The <12>infection of undifferentiated hematopoietic stem cells was confirmed by MSCV/SRα-S65T. These results indicate the use of GFP as a marker for hematopoietic stem cells, the introduction of foreign genes into cells, the short-term isolation of cells, the dynamic interpretation of cell differentiation and proliferation, and the development of gene therapy.