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AAVベクターによる抗腫瘍血管療法と新規アデノ-AAVハイブリッドベクターの開発

使用AAV载体进行抗肿瘤血管治疗以及新型腺-AAV混合载体的开发

基本信息

批准号：
12217131
负责人：
久米晃啓
金额：
$ 3.33万
依托单位：
Jichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12217131/
关键词：
遺伝子治療アデノ随伴ウイルス血管新生

项目摘要

1)血管新生抑制因子NK4およびsFlt発現アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを構築して抗腫瘍活性を検討した。ヒト卵巣がん細胞HRAまたはRMG1に遺伝子導入し、発現細胞株(HRA/Nk4およびRMG/sFlt)を樹立し、培養上清中へのNK4とsFltの分泌を確認した。In vitroにて、HRA/NK4の遊走は対照に比べて著明に抑制され、またRMG/sFltが分泌するsFltが血管内皮増殖因子(VEGF)の作用に拮抗した。ヌードマウスへの腹腔接種実験では、HRA対照群では著明な腹水貯留に伴い15日目までに全例が死亡したのに対し、HRA/NK4接種群では腹水貯留は抑制され、生存期間が有意に延長した。接種8日後の腹膜播種腫瘍数も、HRA/NK4(30±13)が対照(114±35)より有意に少なかった。一方、RMG対照群が著明な血性腹水貯留を伴い平均55日で死亡したのに対し、RMG/sFl接種群では腹水貯留抑制と生存延長(平均70日)が認められた。腹腔内接種5週後の腹水貯留は、対照群平均1.66mlに対し、RMG/sFlt接種群は平均0.1mlと著明に減少していた。2)アデノウイルスとのハイブリッドを応用したAAVプレパッケージング細胞開発に着手した。プレパッケージング細胞安定化のためにはRep蛋白質発現の人為的制御が必要であり、この目的でRepの局在を制御する系と可逆的アンチセンス発現による制御系を検討したが、いずれによっても誘導的AAVベクター産生が可能だった。ただし、プレパッケージング細胞の継代につれてAAV産生が低下したため、より厳格なRep制御を目指して検討中である。また、腫瘍細胞特異的かつ高効率な自殺遺伝子導入を目的として腫瘍内AAV複製システムの開発にも着手した。アデノウィルスE1遺伝子(特異性を得るためE1B55kを欠失)搭載AAVベクター・AAV蛋白質発現カセット搭載アデノウイルスベクターを併用して、数種のp53欠損脳腫瘍株においてAAVベクターを特異的に複製させ得た。

1)Angiogenesis Inhibitor NK4 and sFlt Expression and Activity in Anti-Tumor Cells RMG-1 gene was introduced into HRA cells, and cell lines (HRA/NK-4 and RMG/sFlt) were established. The secretion of NK-4 and sFlt in culture supernatant was confirmed. In vitro, HRA/NK4 migration antagonizes the effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) compared with the inhibitory effects of RMG/sFlt secretion. The intraperitoneal inoculation of the HRA control group resulted in death of all patients within 15 days of ascites storage. The HRA/NK4 vaccination group suppressed ascites storage and intentionally extended its survival period. 8 days after inoculation, HRA/NK ratio was 4(30±13), and the contrast was 114±35. In one group, RMG/sFl vaccination group showed significant inhibition of ascites retention and prolonged survival (mean 55 days). 5 weeks after intraperitoneal inoculation, ascites retention decreased by 1.66 ml in the control group and 0.1 ml in the RMG/sFlt group. 2) Start with cell development It is necessary to control the production of Rep protein artificially in order to stabilize the cells. The purpose of this study is to control the production of Rep protein in a reversible way. AAV production is low and Rep control is low. The goal of high efficiency suicide gene introduction and the development of AAV replication in tumor cells AAV protein development using AAV vector E1 gene (specificity acquired) AAV vector E1 B55k (specificity acquired) AAV vector E1 protein development using AAV vector E1 gene (specificity acquired) AAV vector E1 B55k (specificity acquired) AAV vector E1 protein development using AAV vector E1 gene E1 gene (specificity acquired) AAV vector E1 B55k (specificity acquired) AAV vector