ホスホリパーゼA2活性調節機構とそのプロテインキナーゼC活性化に果たす役割の研究

(A)無細胞系(Cell lysate)におけるアラキドン酸非選択的PLA_2の活性調節機構の検討を行った。(a)ヒト白血病細胞株U-937細胞及びHL-60細胞をさまざまな条件で破砕し無細胞系を作成し、エレクトロポレーション法により得られた細胞レベルにおけるPLA_2活性調節機構に関する知見が無細胞系において再現できるか否かを検討した。その結果、無細胞系においては同様の活性調節機構はみられず、相対的にPLA_2活性が上昇していることが観察された。(a)アラキドン酸非選択的PLA_2の活性を単一蛋白質として分離するために必要な知見を得るために細胞レベルで観察されたアラキドン酸非選択的PLA_2活性が細胞内のどのコンパートメントに存在するかを検討した。その結果、基質特異性、活性化因子(PH,Ca^<2+>依存性)などが酵素学的に異なるPLA_2の活性が核、ミトコンドリア、細胞質、細胞膜画分それぞれに見られた。それらのうちエレクトロポレーション法により得られた細胞レベルにおけるPLA_2活性と酵素学的に類似するものは、細胞質、細胞膜画分に存在した。(B)アラキドン酸非選択的PLA_2をヒト白血病細胞株U-937細胞、HL-60細胞、及びラット脳より精製を行っているが、現在のところそれぞれ精製倍率1000倍から100倍の部分精製となっている。酵素学的にはホスホリパーゼA_2、ホスホリパーゼA_1、リゾホスホリパーゼA活性を有しており、いずれもCa^<2+>を要求しなかった。PKC活性化に果たす役割についてはチロジンリン酸化されたPKCδとされていないPKCδを用いて検討した。PKCδは試験管内ではその活性が不飽和脂肪酸により抑制されることがわっかっていたが、チロジンリン酸化はその抑制作用に影響しないことがわかった。

(A)無細胞系(Cell lysate)におけるアラキドン酸非選択的PLA_2の活性調節機構の検討を行った。(a)ヒト白血病細胞株U-937細胞及びHL-60細胞をさまざまな条件で破砕し無細胞系を作成し、エレクトロポレーション法により得られた細胞レベルにおけるPLA_2活性調節機構に関する知見が無細胞系において再現できるか否かを検討した。その結果、無細胞系においては同様の活性調節機構はみられず、相対的にPLA_2活性が上昇していることが観察された。(a)アラキドン酸非選択的PLA_2の活性を単一蛋白質として分離するために必要な知見を得るために細胞レベルで観察されたアラキドン酸非選択的PLA_2活性が細胞内のどのコンパートメントに存在するかを検討した。その結果、基質特異性、活性化因子(PH,Ca^<2+>依存性)などが酵素学的に異なるPLA_2の活性が核、ミトコンドリア、細胞質、細胞膜画分それぞれに見られた。それらのうちエレクトロポレーション法により得られた細胞レベルにおけるPLA_2活性と酵素学的に類似するものは、細胞質、細胞膜画分に存在した。(B)アラキドン酸非選択的PLA_2をヒト白血病細胞株U-937細胞、HL-60細胞、及びラット脳より精製を行っているが、現在のところそれぞれ精製倍率1000倍から100倍の部分精製となっている。酵素学的にはホスホリパーゼA_2、ホスホリパーゼA_1、リゾホスホリパーゼA活性を有しており、いずれもCa^<2+>を要求しなかった。PKC活性化に果たす役割についてはチロジンリン酸化されたPKCδとされていないPKCδを用いて検討した。PKCδは試験管内ではその活性が不飽和脂肪酸により抑制されることがわっかっていたが、チロジンリン酸化はその抑制作用に影響しないことがわかった。