選択的安定同位体標識を用いた高分子量タンパク質複合体の溶液構造決定法の開発

利用选择性稳定同位素标记开发高分子量蛋白质复合物的溶液结构测定方法

基本信息

批准号：
10179221
负责人：
伊藤隆
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

平成10年度は主として,(1)高分子量タンパク質におけるアロマティックアミノ酸側鎖シグナル解析のための安定同位体標識法およびNMR測定法の開発,(2)選択的プロトン標識を用いた高分子量タンパク質のglobal foldの決定,の2点について研究を行った.(1)については,アロマティック側鎖の磁化を,分離のよいアミド窒素,アミドプロトンに伝達させて観測する経路を考え,新しいパルス・シークエンスを考案した.またこれらの測定においては,Cβ/Cαを経由した磁化の伝達の際に著しい感度低下が予想されたために,Hβ/Hαを選択的に2H標識することを試みた.安定同位体標識試料は,大腸菌での大量発現系を用いてα/β-^2H/^<13>C/^<15>N-Pheを取り込ませることによって調製した.モデル試料(〜1mM)を用いて上記の測定を行ったところ,すべてのPhe残基側鎖のシグナルを,実験上妥当な感度で観測することができた.またα/β選択的^2H標識によって著しい感度上昇が得られることが判明した.この手法は高分子量タンパク質におけるPhe/Tyr残基側鎖シグナルの帰属に普遍的に利用できる.(2)については,分子量27Kの酵母YUH1を用いて研究を行った.試料として,Ile/Leu/Val/Phe/Tyr残基を^1H/^<15>N標識し,他をユニフォーム^2H/^<15>N標識したものと,Ile/Leu/Valを^1H/^<13>C/^<15>Nで,またPhe/Tyrを^1H/^<15>N標識し,他をユニフォーム^2H/^<15>N標識したものを作成した.この手法を用いることによってシグナルのオーバーラップが緩和され,速やかに側鎖シグナルの帰属を行うことができた.さらにこれらの試料について観測した3D NOESYスペクトルを解析しglobal foldの決定を行った.

在1998财年中，主要（1）稳定的同位素标记和NMR分析的发展，用于分析高分子量蛋白中芳族氨基酸侧链信号，以及（2）使用选择性质子标记的高分子量蛋白的全球化。我们研究了两点确定。对于（1），我们考虑了通过将磁化磁化转移到酰胺氮和酰胺质子的途径，并提出了新的脉冲序列，以观察芳族侧链的磁化途径。在这些测量值中，我们预测通过Cβ/Cα转移磁化时灵敏度显着降低，因此试图选择性地标记Hβ/Hα。稳定的同位素标记样品是通过在大肠杆菌中使用大规模表达系统的α/β-^2H/^<13> c/^<15> N-PHE制备的。使用模型样品（〜1 mm）进行上述测量值，并以实验灵敏度观察到所有PHE残基的信号。此外，α/β选择性 ^2H标记显着差异。发现获得了灵敏度的提高。该技术可普遍用于分配高分子量蛋白中PHE/TYR残基的侧链信号。对于（2），我们使用酵母Yuh1进行了一项研究，分子量为27K。作为样本，ILE/LEU/Val/Phe/Tyr残留物被标记为^1H/^<15> n，其他残留物被标记为均匀的^2H/^<15> n，ile/leu/vAR，^1H/^<13> c/^<15> n，其他残留物和其他残留物被标记为均匀的^2H/^<15> n和其他残留物。使用这种技术，信号的重叠得到了缓解，从而可以快速分配侧链信号。此外，观察到这些样品的3D分析了贵族频谱并确定了整体折叠。