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In-Cell NMRを用いた生細胞内蛋白質の物性・動態解析法の開発

开发一种使用细胞内核磁共振分析活细胞中蛋白质的物理性质和动力学的方法

基本信息

批准号：
20050024
负责人：
伊藤隆
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Tokyo Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20050024/
关键词：
in-cell NMR 蛋白質高次構造ダイナミクス大腸菌 NMR 緩和速度解析細胞内環境

项目摘要

生きた細胞における蛋白質分子の物性や動態を調べるために,原核生物(バクテリア)を試料としたin-cell NMR法を用いる,新しい解析手法の開発と応用に関する研究を行うことを目的とする,In-cell NMRには,生細胞内の生体高分子の高次構造や,比較的遅いタイムスケールの分子動態をアミノ酸～原子分解能で解析できるほぼ唯一の手法としての潜在的な有用性がある.一方で様々な生体高分子に普遍的に使用できるツールとなるためには手法として未成熟な点が多く,方法論的研究が希求されている.H21年度は,昨年に引き続き,大腸菌のin-cell NMRを用いて,生きた大腸菌の中の蛋白質の立体構造解析を行った.試料としては連鎖球菌のプロテインGB1ドメインを用いた.これまでの解析から,生細胞試料から得たNOE情報を用いることで,グローバル・フォールドを決定することに成功した.現在進めている構造の精密化が完了すれば,2009年に報告した高度好熱菌TTHA1718に続く,世界で2番目の高次構造決定例となる.また,生きた大腸菌の中の蛋白質の動的性質の解析も継続して行った,具体的には,in-cell NMRを用いて,大腸菌の中の高度好熱菌TTHA1718蛋白質の主鎖^<15>N核のT_1およびT_2緩和時間の測定を行い,蛋白質主鎖のダイナミクスの解析を行った.解析の結果,細胞内の粘度(水溶液の約3倍)に対応する回転相関時間の増大が観測されたが,これに加えて,何らかの原因による^<15>N核のT^2緩和時間の著しい短縮が観測された.

In-cell NMR was used to study the higher-order structure of living macromolecules in living cells. The molecular dynamics of the comparison system are analyzed by the acid ~ atomic decomposition energy, and the potential usefulness of the method is discussed. A common use of biological polymers is to study the methodology of biological polymers. In 2001, the use of in-cell NMR in Escherichia coli was introduced, and the three-dimensional structure analysis of proteins in Escherichia coli was carried out. The sample was used to detect the presence of a chain of bacteria. This analysis was successful in determining the NOE information from the raw cell sample. Now the refinement of structure is complete. In 2009, the report of high temperature bacteria TTHA1718 was published, and the world's two high-order structure determination examples were reported. The analysis of protein kinetic properties in Escherichia coli was carried out by in-cell NMR. The determination of <15>T_1 and T_2 relaxation time of protein main lock in Escherichia coli TTHA1718 was carried out. As a result of analysis, the increase in the correlation time of the intracellular viscosity (about 3 times that of aqueous solution) and the decrease in <15>the T^2 relaxation time of the nucleus were measured.