胆嚢癌に対する遺伝子治療とテロメラーゼ測定の意義

基因治疗和端粒酶测量对胆囊癌的意义

• 批准号: 10671196
• 负责人: 小川 尚洋
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10671196/
• 关键词: 胆嚢癌; 遺伝子治療; p53; p21; テロメラーゼ; アデノウイルスベクター

本年度は研究計画にのっとり以下の4点を中心に研究してきた。1)胆嚢癌細胞GB-d1へのP21及びp53遺伝子導入の証明:ウェスタンブロッティングにてp21遺伝子導入群におけるp21タンパクの発現とp53遺伝子導入群におけるp21の発現を伴うp53タンパクの過剰発現を認めた。2)GB-d1へのp21及びp53遺伝子導入のin vitroにおける増殖抑制効果及び死細胞率の増加:24well plateに50000/wellの細胞をまき48時間後に115840になった時点でp21及びp53遺伝子組換えアデノウイルスをmoi 100で感染させ遺伝子を導入し経時的に細胞数を測定した。感染3日後にはそれぞれ107640,107440となり無感染群の396000やコントロールウイルス感染群の264400と比較して有意に増殖を抑制した。同様な感染後,プロピディウムアイオダイドで細胞を染色しmultiple well plate readerを用いて蛍光光度を解析し死細胞率を経時的に測定した。感染3日後にはp21遺伝子導入群では18%,p53遺伝子導入群では24%と著明な死細胞率の増加を認めた。3)GB-d1へのp21及びp53遺伝子導入による細胞周期の変動:感染2日後のフローサイトメトリーによる細胞周期の解析において,p21遺伝子導入群では細胞周期のG1期停止を,p53遺伝子導入群ではsubGl領域の出現すなわちアポトーシスを認めた。4)GB-d1へのp21及びp53遺伝子導入によるテロメラーゼ及びTERTに対する影響:細胞1000個あたりのテロメラーゼ活性をTRAP法にて測定したところ,p21遺伝子導入群ではほとんど変化は無かったが,p53遺伝子導入群においては感染2日後で感染前の48%に,感染3日後には完全に抑制した。またテロメラーゼの触媒サブユニットでテロメラーゼ活性と相関があるTERTのメッセンジャーRNAをRT-PCRで測定し、p53遺伝子導入はTERTの発現を感染2日後に抑制することを認めた。以上より胆嚢癌に対するp21及びp53遺伝子治療は有効であると考え,またp53はテロメラーゼを抑制する因子の1つであることが示唆された。現在in vivoにおける研究を進めている。

This year's research plan includes the following four points: 1)Proof of p21 and p53 gene introduction into GB-d1 cancer cells: identification of p21 gene introduction group and p53 gene introduction group. 2) Growth inhibition effect and increase of dead cell rate of GB-d1 gene p21 and p53 gene introduced in vitro: 50000/well cells in 24well plate after 48 hours at 115840 hours at the time point of p21 and p53 gene group exchange and moi 100 hours at the time of gene introduction. Three days after infection, the number of infected individuals was 107640, 107440, 396000 and 264400 respectively. After the same infection, cells were stained on the surface of the skin, multiple well plate readers were used to analyze the light intensity, and the rate of dead cells was determined at the same time. 3 days after infection, the percentage of dead cells in the p21 and p53 gene introductions increased by 18% and 24% respectively. 3) Cell cycle changes during GB-d1 gene p21 and p53 gene introductions: cell cycle analysis 2 days after infection, cell cycle arrest in G1 phase of p21 gene introductions, and emergence of subG1 domain in p53 gene introductions were identified. 4)GB-d1 gene p21 and p53 gene introduced into the virus and its influence on TERT: 1000 cells were infected with p21 gene and its activity was measured by TRAP method. The expression of p53 gene was detected by RT-PCR and the expression of p53 gene was inhibited after 2 days. The p21 and p53 gene therapy for biliary cancer is effective, and the p53 gene therapy is effective. Now in vivo, research is progressing.