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制癌の標的分子としての糖脂質糖鎖遺伝子(ガングリオシドGM3合成酵素遺伝子)

糖脂糖链基因（神经节苷脂GM3合酶基因）作为癌症预防的靶分子

基本信息

批准号：
10153204
负责人：
齋藤政樹
金额：
$ 2.94万
依托单位：
National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

当該研究期間内に、以下の諸点を明らかにした:(1)酸性糖脂質ガングリオシド合成系のキーエンザイムであるヒトGM3合成シアル酸転移酵素の遺伝子のゲノム構造解析を行った。ヒト染色体DNAのBACライブラリーをスクリーニングすることによって、ゲノム全長を含むゲノミックローンを単離し、さらにエクソン・イントロン構造の解明と転写開始点の決定を行い、FISH法により当該遺伝子の染色体上の位置(2p11.1)を確認した。マウスの当該遺伝子の染色体上の位置は6Cであった。(2)マウスでは5'-RACE法で最上流エクソンのみが異なる3種類の転写物(L型、B1型、B2型)が明らかになった。ノーザンブロット解析で組織及び種特異性が明らかになった。ラット及びサルGM3合成酵素cDNAをクローニングしヒト及びマウス遺伝子と比較検討した。これらの単離ホモローグにもヒト及びマウスで見られたアミノ酸置換(アスパラギン酸がヒスチジンに置換)が確認され、哺乳類でこのアミノ酸置換の重要な意味が内包されていることが示唆された。(3)本酵素はペプチド部が41.2-41.7kDaの糖蛋白質であると推定され、C末端をMyc-tag標識したConstructでWestern blot解析した。N結合型糖鎖結合可能部位に突然変異を入れ、野生型と糖鎖欠損型酵素の酵素活性・動態を比較し、シアリルモチーフL中の特異的なHis177残基の変異体を作製し、酵素活性・動態を比較したが、明確な結論には至っていない。ガングリオシドの包括的生物機能解析のためGM3合成酵素欠損マウス作出のためのターゲッチングベクターの構築を行い、ES細胞への導入を開始した。(4)ヒト遺伝子ノックアウト細胞作成のため、GM3合成酵素ゲノムDNAからpositive and negative selection vector及びpromoter less vectorを作成、数種類の付着性及び浮遊性がん細胞株に導入しホモ相同組み換えを起こした細胞のクローニングを開始した。(5)またメラノーマ12日本人症例から4症例の細胞株化に成功した。コーカシアン系のメラノーマ細胞株を含め5株の培養細胞に、GD3合成酵素cDNAを組み込んだsense及びantisense vectorを導入し、変異株を複数分離した。antisense vector導入株の一部に、GD3産生能低下と増殖能低下を認めた。

During the period of the study, the following points show that: (1) Acid glycolipid synthesis is effective in the synthesis of acid transfer enzymes in GM3 synthesis. The chromosomes DNA, BAC, and FISH are used to determine the location (2p11.1) on the chromosome of the child, and the whole length of the system includes the identification of the location (2p11.1) on the chromosome. The position is 6C on the chromosome of the child. (2) the most advanced 5'-RACE method shows that the most advanced writing (L-type, B1-type, B2-type) is accurate and accurate. Please tell us how to analyze the organization and the characteristics of the organization. The GM3 synthesis enzymes, cDNA, enzyme, and enzyme. Please do not know if it is important to make sure that it is important that you do not know what you are doing. (3) 41.7kDa, glycoprotein, presumption, C-terminal Myc-tag tag, Construct, Western blot analysis. The possible sites of N-conjugated glycosaminoglycans were sudden entry, wild-type glucose deficiency enzyme activity assay, enzyme activity assay and enzyme activity assay. The system includes a biological machine that can analyze the GM3 synthesis enzyme and make a real-time response. You need to do a lot of work, and you can start the ES system. (4) the production of GM3 synthesis enzymes, DNA enzyme positive and negative selection vector and promoter less vector cell lines in the same cell cycle began to occur in the same system. (5) on the 12th, there were 4 cases, and the cell transformation was successful. The cell line contains 5 strains of cultured cells, GD3 synthase, cDNA enzyme, sense, antisense vector, and multiplicative isolates. The first plant of antisense vector, the low energy of GD3, and the low fertility of GD3 were recognized.