制癌の標的分子としての糖脂質糖鎖遺伝子(ガングリオシドGM3合成酵素遺伝子)

糖脂糖链基因（神经节苷脂GM3合酶基因）作为癌症预防的靶分子

• 批准号: 11140282
• 负责人: 齋藤 政樹
• 金额: $ 4.8万
• 依托单位: National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11140282/
• 关键词: ガングリオシドGM3合成酵素; シアル酸転移酵素; 5｀-RACE法; GM3合成酵素欠損マウス; N結合型糖鎖; シリアルモチーフ; ガングリオシドGD3合成酵素; 遺伝子ノックアウト細胞

当該研究期間内に、以下の諸点を明らかにした:(1)酸性糖脂質ガングリオシド合成系のキーエンザイムであるヒトGM3合成シアル酸転移酵素の遺伝子のゲノム構造解析を行った。ヒト染色体DNAのBACライブラリーをスクリーニングすることによって、ゲノム全長を含むゲノミックローンを単離し、さらにエクソン・イントロン構造の解明と転写開始点の決定を行い、FISH法により当該遺伝子の染色体上の位置(2p11.1)を確認した。マウスの当該遺伝子の染色体上の位置は6Cであった。(2)マウスでは5'-RACE法で最上流エクソンのみが異なる3種類の転写物(L型、B1型、B2型)が明らかになった。ノーザンブロット解析で組織及び種特異性が明らかになった。ラット及びサルGM3合成酵素cDNAをクローニングしヒト及びマウス遺伝子と比較検討した。これらの単離ホモローグにもヒト及びマウスで見られたアミノ酸置換(アスパラギン酸がヒスチジンに置換)が確認され、哺乳類でこのアミノ酸置換の重要な意味が内包されていることが示唆された。(3)本酵素はペプチド部が41.2-41.7kDaの糖蛋白質であると推定され、C末端をMyc-tag標識したConstructでWestern blot解析した。N結合型糖鎖結合可能部位に突然変異を入れ、野生型と糖鎖欠損型酵素の酵素活性・動態を比較し、シアリルモチーフL中の特異的なHis177残基の変異体を作製し、酵素活性・動態を比較したが、明確な結論には至っていない。ガングリオシドの包括的生物機能解析のためGM3合成酵素欠損マウス作出のためのターゲッチングベクターの構築を行い、ES細胞への導入を開始した。(4)ヒト遺伝子ノックアウト細胞作成のため、GM3合成酵素ゲノムDNAからpositive and negative selection vector及びpromoter less vectorを作成、数種類の付着性及び浮遊性がん細胞株に導入しホモ相同組み換えを起こした細胞のクローニングを開始した。(5)またメラノーマ12日本人症例から4症例の細胞株化に成功した。コーカシアン系のメラノーマ細胞株を含め5株の培養細胞に、GD3合成酵素cDNAを組み込んだsense及びantisense vectorを導入し、変異株を複数分離した。antisense vector導入株の一部に、GD3産生能低下と増殖能低下を認めた。

When the に within the period of the study, the following の point を Ming ら か に し た : (1) acid lipid sugar ガ ン グ リ オ シ ド GeChengXi の キ ー エ ン ザ イ ム で あ る ヒ ト GM3 synthetic シ ア ル acid planning shift enzyme の heritage 伝 son の ゲ ノ ム tectonic line analytical を っ た. ヒ ト chromosome DNA の BAC ラ イ ブ ラ リ ー を ス ク リ ー ニ ン グ す る こ と に よ っ て, ゲ ノ ム span を containing む ゲ ノ ミ ッ ク ロ ー ン を 単 し, さ ら に エ ク ソ ン · イ ン ト ロ ン tectonic の interpret と planning write starting point line の decided を い, FISH に よ り when the legacy 伝 の の locus on a chromosome location (2 p11. 1) confirm し を Youdaoplaceholder0. When the 伝 chromosome is located at position ウス 6Cであった. (2) マ ウ ス で は 5 '- RACE method で the best エ ク ソ ン の み が different な る 3 kinds の planning write content (L type, B1, B2) が Ming ら か に な っ た. Youdaoplaceholder0 ノ ザ ブロット ブロット ブロット analysis of で tissues and び species specificity が Ming ら になった になった. ラ ッ ト and び サ ル GM3 synthetase cDNA を ク ロ ー ニ ン グ し ヒ ト and び マ ウ ス heritage 伝 と comparing beg し 検 た. こ れ ら の 単 from ホ モ ロ ー グ に も ヒ ト and び マ ウ ス で see ら れ た ア ミ ノ acid replacement (ア ス パ ラ ギ ン acid が ヒ ス チ ジ ン に replacement) が confirm さ れ, mammals で こ の ア ミ ノ acid replacement の important な mean が insourcing さ れ て い る こ と が in stopping さ れ た. (3) the enzyme は ペ プ チ ド department が 41.2 41.7 kDa の sugar protein で あ る と presumption さ れ, C terminal を Myc - tag identification し た Construct で Western blot parsing し た. N combined with combination type sugar lock parts に suddenly - probably different を into れ, wild と sugar owe lock damage enzyme の enzyme activity, dynamic を し, シ ア リ ル モ チ ー フ L の specific な His177 residues の - variant を し, enzyme activity, dynamic を compared し た が, clear な conclusion に は to っ て い な い. ガ ン グ リ オ シ ド の including the biological function of parsing の た め GM3 synthetase owe loss マ ウ ス make の た め の タ ー ゲ ッ チ ン グ ベ ク タ ー の line build を い, ES cells へ の import を began し た. (4)ヒト progeny 伝 ノッ アウト cells were used to produce <s:1> ため, GM3 synthase ゲノムDNA らpositive and negative selection vectors and びpromoter less Vector, several kinds の を pay as a sex and び floatability が ん cell lines に import し ホ モ み in same group え を up こ し た cells の ク ロ ー ニ ン グ を began し た. (5)またメラノ またメラノ ら またメラノ on the 12th, the local case ら in case 4, the <s:1> cell line was successfully transformed に and た were achieved. コ ー カ シ ア ン is の メ ラ ノ ー マ cell lines contains を め 5 strains の culture cell に GD3 synthesis and enzyme cDNA を group み 込 ん だ sense and び antisense vector を import し separation, - different strains を plural し た. antisense vector import strain <s:1> part に, GD3 production energy is low と proliferation energy is low を recognition めた.

项目成果

Ishii, A., Saito, M., et al.: "Molecular characterization of ganglioside GM3 synthetic sialyltransierase-1(CMP-NeuAc : Galβ1-4Glc β1-1'Cer α2, 3-sialyltransferase) : Its expression characteristics and genomic structure in humans and mice"J. Biol. Chem.. (

Ishii, A., Saito, M., et al.：“神经节苷脂 GM3 合成唾液酸转移酶-1（CMP-NeuAc : Galβ1-4Glc β1-1Cer α2, 3-唾液酸转移酶）的分子特征：其表达特征和基因组结构在人类和小鼠中“J. Biol. Chem..（

Nakamoto, T., Sakai, R., et al.: "CIZ, a zinc finger protein that interacts with p130(cas) and activates the expression of matrix metalloproteinases"Mol. Cell. Biol.. 20. 1649-1658 (2000)

Nakamoto, T.、Sakai, R. 等人：“CIZ，一种与 p130(cas) 相互作用并激活基质金属蛋白酶表达的锌指蛋白”Mol.

Honda, H., Sakai, R., et al.: "p130Cas, an assembling molecule of actin filaments, promotes cell movement, cell migration, and cell spreading in fibroblasts"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 262. 25-30 (1999)

Honda, H., Sakai, R. 等人：“p130Cas，一种肌动蛋白丝的组装分子，促进成纤维细胞中的细胞运动、细胞迁移和细胞扩散”Biochem.Biophys.Res.Commun.. 262. 25-

Matsugda, K., Saito, M.et al.: "HIV Induction from Latently Infected Cells by Phosphoglycolipid Antigens of Mycoplasma fermentans"Infect. Immun.. (in press). (2000)

Matsugda, K., Saito, M.等人：“发酵支原体磷酸糖脂抗原从潜伏感染细胞中诱导 HIV”感染。

Nishida, Y., Matsuda, K., et al.: "Synthesis and absolute configuration of a novel aminoglycoglycerolipid, species-specific major immunodeterminant of Mycoplasma fermentans"Tetrahedron Lett.. 40. 2371-2374 (1999)

Nishida, Y.、Matsuda, K. 等人：“发酵支原体的物种特异性主要免疫决定簇，新型氨基糖甘油脂的合成和绝对构型”Tetrahedron Lett.. 40. 2371-2374 (1999)