化学修飾を施した天然分岐糖鎖への分岐特異的シアル酸転移酵素反応

化学修饰的天然支链糖链上的支链特异性唾液酸转移酶反应

基本信息

批准号：
13780469
负责人：
梶原康宏
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780469/
关键词：
糖鎖シアル酸分岐糖鎖シアル酸転移酵素

项目摘要

本研究では、糖タンパク質からタンパク質分解酵素を用いて2分岐型糖鎖を単離することからはじめた。2分岐型糖鎖は鶏卵から単離した。2分岐型糖鎖は、アスパラギンが結合した糖鎖アミノ酸として約1グラム得ることができた。そして、この基質に対し、0.1NのHClを作用させ、非還元末端のシアル酸を除去したアシアロ糖鎖へほぼ定量的に変換した。そして、アスパラギンに、Fmoc基、メチルエステル基を導入して有機溶剤に溶けやすい誘導体へと変換後、この糖鎖が有する糖水酸基に対し様々な保護基の導入を試みた。保護基としては、シリル系、アセタール系のものを用いた。シリル系の保護基は、温度等制御して糖鎖への導入数を調整したが、糖鎖の両分岐鎖に、保護基が導入された。結果的には、反応性の高いジメチルアセタール基を用いることで、アセタール化された糖鎖誘導体を数種類得た。これらは、水を展開溶媒に用いることのできるイアトロビースカラムを用いて単離精製したところ、分岐鎖の一方に保護基が導入されたと思われる化合物を得た。次に得られた糖鎖誘導体のどの位置に保護基が導入されたのかを決定するために必要な新規NMR測定法を検討した。その結果、10個程度の糖残基からなる糖鎖の中から単糖のみの2次元COSYスペクトルを得る、2D-seleciveTOCSY-DQFCOSY法、および任意の単糖のプロトン-炭素相関のみ観測できる2D-selectiveTOCSY-HSQC法を確立した。現在は、この測定法を利用して、糖鎖の30個以上ある水酸基のどの位置に保護基が導入されているのか、詳細な解析を検討している。これに平行して、分岐特異的にシアル酸を酵素で転移させる実験に必要なCMP-シアル酸誘導体の合成を行った。誘導体としては、シアル酸の水酸基がデオキシ化されたCMP-デオキシ-シアル酸の化学合成を検討した。この誘導体を分岐した糖鎖の末端に転移させることで、生体内レクチン等が分岐鎖末端のどちらのシアル酸のどの水酸基を強く認識しているか調べるためのプローブを得ることができる。そして検討した結果、相当するCMP-デオキシ-シアル酸を4種類合成することができた。現在は、これら誘導体を用いて保護基の導入された糖鎖への転移反応と糖鎖の構造決定を検討している。

这项研究首先使用蛋白酶从糖蛋白中分离出两条聚糖。从鸡蛋中分离出两条糖链。两条糖链是作为与天冬酰胺结合的糖链氨基酸获得的。然后，将该基材采取0.1N HCl的作用，以将其转换为Asialogycosylated链，该链已从非还原末端从唾液酸中取出。在将FMOC组和甲基酯基引入天冬酰胺后，它被转化为一种衍生物，很容易溶于有机溶剂中，试图将各种保护基团引入糖链中包含的糖羟基中。作为保护组，使用甲硅烷基型或乙酰型组。通过控制温度等调节基于水硅烷基的保护组的数量，但将保护组引入了糖链的两个支链中。结果，通过使用高反应性二甲基阈值基团获得了几种类型的乙酰化糖链衍生物。这些化合物是通过iachtobys柱进行分离和纯化的，该柱允许水用作发育型溶剂，因此获得了一种化合物，其中可能将保护组引入其中一个分支链中。接下来，检查了确定保护组在所得的聚糖衍生物中引入何处所需的新型NMR分析。结果，我们已经建立了2D选择性的Tocsy-DQFCosy方法，该方法从大约10种糖残基和由2D-选择性Tocsy-HSQC方法组成的糖链中获得了二维舒适频谱，仅允许使用任何单声型的proton-coman-coramications。当前，使用这种测量方法，我们正在考虑在30多个糖链的羟基中引入保护组的详细分析。与此同时，合成了唾液酸特异性转移唾液酸所需的CMP-Sialic酸衍生物。作为衍生物，研究了CMP-脱氧 - 硅酸的化学合成，其中研究了唾液酸的羟基。通过将该衍生物转移到分支糖链的末端，可以获得一个探针，以检查哪个羟基在分支链末端的盐酸在哪个盐酸的末端被体内凝集素强烈识别。调查结果，合成了四种类型的相应的CMP脱氧 - 硅酸。当前，我们正在考虑使用这些衍生物将糖链转移到引入保护组并确定糖链结构的糖链中。