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大腸菌の膜結合性コハク酸ユビキノン酸化還元酵素複合体のX線構造解析

大肠杆菌膜结合琥珀酸-泛醌氧化还原酶复合物的 X 射线结构分析

基本信息

批准号：
11169211
负责人：
原田繁春
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

大腸菌の膜結合性コハク酸ユビキノン酸化還元酵素複合体(SDH)の立体構造をX線結晶構造解析で解明し、その構造と機能の関係を明らかにするために、これまでに得られているSDH結晶の質の改良と再現性の向上を行った。結晶化に使うサンプルは、大量発現系を構築した大腸菌を培養、その内膜中に存在するSDHを界面活性剤スクロースモノラウレートで可溶化し、ルブロール存在下でカラム精製を行い調製した。このようにして精製したサンプルは、従来、安定性に乏しく数日で失活していたが、競合阻害剤であるマロン酸を共存させることで格段に安定性が増した。さらに、結晶化の際にルブロールだけでなく、ドデシルマルトシドやデシルマルトシドなどの界面活性剤との混合系を使用することで、結晶化の再現性を向上させることができた。この時の混合比は、SDHの結晶化の際のポリエチレングリコール濃度より少し高い濃度で、混合界面活性剤溶液に相分離が起こるような比率が良いことが分かった。このような条件下では、界面活性剤ミセル間の相互作用が強くなるため、疎水性部分を界面活性剤で取り囲まれているSDH分子間の相互作用も強くなり、結晶化が促進されるものと考えられる。そこで、様々な比率で界面活性剤混合溶液を調製し、それが相分離するのに必要なポリエチレングリコールの濃度を求めて相図を作製した。それをもとに、これまで使ったことのなかった界面活性剤混合系でSDHの結晶化を試みたところ、新たな結晶化条件を見つけることができた。現在、これらの結晶について、X線回折実験を行い、構造解析に適した結晶であるかどうかを調べている。

X-ray crystallographic analysis of the three-dimensional structure of the membrane-binding enzyme complex (SDH) of Escherichia coli reveals the relationship between structure and function, and the improvement of SDH crystal quality and reproducibility. Crystallization, mass production system construction, coliform culture, SDH, interfacial active agent, solubilization, purification in the presence of SDH The stability of the product is increased due to the lack of activity and competition. In addition, the crystallization process is characterized by high reproducibility and high interfacial activity. The mixing ratio of the mixed interface active agent solution and the crystallization ratio of SDH are different from each other. Under these conditions, the interaction between SDH molecules is stronger and the crystallization is promoted. The ratio of the surfactant to the mixture is adjusted and the phase separation is determined. The crystallization of SDH was studied by using the mixed system of interface active agents. Now, this is the crystallization process, X-ray reflection process, structural analysis is suitable for crystallization process.