ブタ肝臓ミクロソーム電子伝達系生物マシーナリーの立体構造と機能に関する研究

猪肝微粒体电子传递系统生物机械三维结构与功能研究

• 批准号: 11169235
• 负责人: 木村 成伸
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Himeji Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11169235/
• 关键词: 電子伝達系; フラビン酵素; シトクロムb_5還元酵素; 変異導入; 生物マシーナリー

本研究では、集合型生物マシーナリーである肝細胞ミクロソーム電子伝達酵素群について、同一生物種(ブタ)由来の酵素群を用いてその電子伝達機能および分子間認識機構を解明することを目的としている。1.本マシーナリーの構成酵素のひとつであるブタ肝臓由来NADH-シトクロムb_5還元酵素(Pb5R)中に存在する、フラビン還元酵素ファミリーに共通に見られるフラビン結合モチーフ(RXY(T/S)+(T/S)モチーフ)アミノ酸残基置換変異体の電子伝達機能を解析して、本モチーフ中のArg^<63>側鎖正電荷およびSer^<99>側鎖水酸基が、FADのみならずNADHとの結合にも重要であること、および、Arg^<63>側鎖正電荷がシトクロムb_5への特異的電子伝達に関与していることを明らかにした。また、Thr^<66>置換変異体(T66A、T66S、T66V、T66N、及びT66D)のストップトフロー法による電子伝達機能の解析を行い、Thr^<66>の置換が電子伝達中に生じるFADセミキノン分子種とその酸化速度に影響を与え、酵素反応サイクルの律速段階を変化させることを見いだした。2.Pb5RのHis^<49>置換変異体H49EのX線結晶構造解析を終了し、H49Eの電子伝達機能変化が、FADを含む局所的な構造変化によることを明らかにした。H49Kについても現在X線結晶構造解析を進めている。3.ブタ肝臓シトクロムP-450還元酵素可溶化ドメイン(PCPR)構造遺伝子のN末端領域への変異導入により、PCPRの大腸菌による大量発現に成功した。今後も引き続き、Pb5R変異体、ブタ肝臓シトクロムb_5-Pb5R複合体、Pb5-PCPR複合体の結晶化を進める。

This study で は type, sets, biological マ シ ー ナ リ ー で あ る hepatocellular ミ ク ロ ソ ー ム electronic 伝 group of enzyme に つ い て, the same kind of (ブ タ) origin を の enzyme group with い て そ の electronic 伝 of functional お よ び intermolecular know institutions を interpret す る こ と を purpose と し て い る. 1. This マ シ ー ナ リ ー の constitute enzyme の ひ と つ で あ る ブ タ routine liver origin NADH - シ ト ク ロ ム b_5 existed yuan enzyme (Pb5R) に す る, フ ラ ビ ン also yuan enzyme フ ァ ミ リ ー に に see common ら れ る フ ラ ビ ン combining モ チ ー フ (RXY (T/S) + (T/S) モ チ ー フ) ア ミ ノ acid residue displacement - variant の Function of electronic 伝 da を parsing し て, this モ チ ー フ の in Arg ^ < 63 > side chain positive charge お よ び Ser ^ < 99 > water side chain acid base が, FAD の み な ら ず NADH と の combining に も important で あ る こ と, お よ び, Arg ^ < 63 > side chain positive charge が シ ト ク ロ ム b_5 へ の specific electronic 伝 da に masato and し て い る こ と Youdaoplaceholder0 Ming ら た に た た. ま た, Thr ^ < 66 > replacement - variants (T66A T66S T66V, T66N and び T66D) の ス ト ッ プ ト フ ロ ー method に よ る electronic 伝 line function analytical を の い, Thr ^ < 66 > の replacement が に in electronic 伝 da じ る FAD セ ミ キ ノ ン molecules of と そ の に acidification speed of を and anti 応 え, enzyme Youdaoplaceholder0 とを <s:1> とを を the transformation of the tinea speed order を させる とを とを see だ だ た た. 2. Pb5R の ihs ^ < > 49 replacement - variant H49E の し, end of the X-ray crystal structure analytic を H49E の electronic 伝 of function - が, FAD を containing む な structural variations of bureau に よ る こ と を Ming ら か に し た. H49Kに に て て now X-ray crystal structure analysis を enters めて る る る. 3. ブ タ routine liver シ ト ク ロ ム P - 450 also yuan enzyme can melt ド メ イ ン (PCPR) tectonic heritage 伝 son の N terminal areas へ の - different import に よ り, PCPR の coliform に よ る large 発 に success now し た. In the future, we will introduce 続 続 続, Pb5R variants, ブタ liver シト ロム ロムb_5-Pb5R complex, Pb5-PCPR complex <s:1> crystallization を into める.

项目成果

Shigenobu Kimura et al.: "Systematic mutations of highly conserved His^<49> and carboxyl-terminal of recombinant porcine liver NADH-cytochrome b_5 reductase solubilized domain"Biochim. Biophys. Acta. 1430. 290-301 (1999)

Shigenobu Kimura等人：“重组猪肝NADH-细胞色素b_5还原酶溶解结构域的高度保守的His 49 和羧基末端的系统突变”Biochim。

Shigenobu Kimura er al.: "Amino acid substitutions near the FAD in NADH-cytochrome b_5 reductase : roles of Arg^<63> and Thr^<66> in the electron transfer"Flavins and Flavoproteins 1999 (Ghisla S, Kroneck P Macheroux P, Sund H, Eds), Agency for Scientific

Shigenobu Kimura 等人：“NADH-细胞色素 b_5 还原酶中 FAD 附近的氨基酸取代：Arg^<63> 和 Thr^<66> 在电子转移中的作用”黄素和黄素蛋白 1999 (Ghisla S, Kroneck P Macheroux P