分子認識性オリゴヌクレオチドライブラリーの調節と動物細胞系への応用

分子识别寡核苷酸文库的调控及其在动物细胞系统中的应用

• 批准号: 12019207
• 负责人: 大嶋 孝之
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12019207/
• 关键词: オリゴヌクレオチド; 一本鎖; 分子認識; 動物細胞; 液; 液界面

近年DNA、RNA等の核酸分子の分子認識能が注目されている。本研究では分子認識素子としての核酸分子の設計を行い、その実用性を実証した。またターゲットに結合した核酸分子の回収・分析・増幅方法の確立を行った。シングルループやダブルループの二次構造を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリーをいくつか合成した。これらを用いて種々のターゲットタンパク質に対してwesternブロットおよびdotブロットを行うとシグナルが検出されたことから、一本鎖オリゴヌクレオチドとタンパク質が結合していることが確認できた。しかしターゲットタンパク質が高濃度に存在すると結合できない現象も確認された。ターゲットタンパク質と結合したDNA分子の回収・増幅方法について検討した。フィルターからの回収方法としてはシグナル部分を切り出し、適量のTE bufferで浸し、100℃、10minを行うことで回収できることがわかった。また結合した一本鎖オリゴヌクレオチドの増幅方法としてはビオチン化プライマーとアビジン化アガロースを用いる方法で回収できることが確認できた。またこれらの一本鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列を決定するため、直接回収したオリゴヌクレオチドをテンプレートとして試みたが、短いため困難であった。そこでプラスミドに一度組換えて行う方法を試み、解読することが可能となった。また液/液界面培養法で形成された細胞集合体とコラーゲンコートウェルで単層培養した細胞との細胞表層に提示されている分子の違いについては、凍結融解による細胞の破砕と表層タンパク質の分離を試み、それぞれの成分の分離に成功している。これらのサンプルのSDS-PAGEではほとんど違いは認められなかった。今後このサンプルに開発中の一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリーを応用していく必要がある。

In recent years, the recognition of <s:1> nucleic acid molecules such as DNA and RNA has attracted が attention to されて る る る. In this study, the design of the で で molecular recognition molecule, the と て て, the て nucleic acid molecule, the を feasibility, the そ, the practical feasibility, the を practical evidence, and the た. Youdaoplaceholder0 ゲットに ゲットに combined with the <s:1> た nucleic acid molecule <s:1> reabsorption · analysis · amplification method <e:1> established the を line った. シ ン グ ル ル ー プ や ダ ブ ル ル ー プ の secondary tectonic を hold つ a lock オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド ラ イ ブ ラ リ ー を い く つ か synthetic し た. こ れ ら を with い て kind 々 の タ ー ゲ ッ ト タ ン パ ク qualitative に し seaborne て western ブ ロ ッ ト お よ び dot ブ ロ ッ ト を line う と シ グ ナ ル が 検 out さ れ た こ と か ら, a lock オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と タ ン パ ク qualitative が combining し て い る こ と が confirm で き た. し か し タ ー ゲ ッ ト タ ン パ ク qualitative が high-concentration に exist す る と combining で き な い phenomenon も confirm さ れ た. Youdaoplaceholder0 タ ゲットタ パ パ パ パ the method of reproducing and amplifying the と combined with the <s:1> たDNA molecule に に て検 て検 て検 to obtain た. フ ィ ル タ ー か ら の back 収 method と し て は シ グ ナ ル part cut を り し, moderate の TE buffer で leaching し line, 100 ℃, 10 min を う こ と で back 収 で き る こ と が わ か っ た. ま た combining し た a lock オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド の rights of way と し て は ビ オ チ ン change プ ラ イ マ ー と ア ビ ジ ン change ア ガ ロ ー ス を with い る method で back 収 で き る こ と が confirm で き た. ま た こ れ ら の a lock オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド の salt base with column を decided す る た め, directly back to 収 し た オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を テ ン プ レ ー ト と し て try み た が, short い た め difficult で あ っ た. そ こ で プ ラ ス ミ ド に once set in え て を try み う method, solution 読 す る こ と が may と な っ た. ま た liquid/liquid interface culture method で form さ れ た cells aggregate と コ ラ ー ゲ ン コ ー ト ウ ェ ル で 単 layer culture し た cells と の cell surface に prompt さ れ て い い る molecular の spare に つ い て は and freeze melting に よ る cells の broken 砕 と surface タ ン パ ク の the separation を み, そ れ ぞ れ の component separation の に successful し て い る. Youdaoplaceholder2 れら サ サ プ プ められな <s:1> SDS-PAGEで ほとん ほとん <s:1> violation of <s:1> recognition められな められな った った. Future こ の サ ン プ ル に の a lock in open 発 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド ラ イ ブ ラ リ ー を 応 with し て い く necessary が あ る.

项目成果

芝良昭,片野又兵衛,大嶋孝之,佐藤正之: "液/液界面において長期培養された付着依存性動物細胞の代謝活性"化学工学論文集. (受理済).

Yoshiaki Shiba、Matabei Katano、Takayuki Oshima、Masayuki Sato：“在液/液界面长期培养的附着依赖性动物细胞的代谢活性”《化学工程杂志》（已接受）。