細胞形質を指標とした疾患関連遺伝子単離・同定法の開発

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ゲノム情報が急速に蓄積されつつある現在、その情報が本来有する生物活性の迅速な同定ならびにゲノム多型情報に対応する生物活性定量法の開発は重要な意義をもつ。本研究は、特定の細胞形質発現をつかさどる遺伝子群を(1)細胞への効率良いcDNA発現ライブラリーの導入(2)目的とする細胞形質を獲得した細胞の選択・選別(3)部位特異的リコンビナーゼによるcDNAの染色体からの切り出し・回収(4)回収されたcDNAの再導入による細胞の再形質転換から構成される過程を繰り返すことにより、迅速かつ包括的に濃縮・単離する系を樹立することを目的とした。まず、テトラサイクリンならびにIPTGの二重制御を受ける誘導発現プロモーター(TcIPプロモーター)の下流に酵母由来の部位特異的リコンビナーゼであるKwリコンビナーゼ遺伝子を接続し、インターロイキン3(IL-3)依存性リンパ系細胞株BaF3に安定的に導入した。得られたトランスフェクタントから、IPTG添加によりKwリコンビナーゼを誘導発現する安定変異細胞株BaF/Kwを樹立した。次に、BaF3細胞株から調整したpolyA(+)RNAを用いてcDNAライブラリーを作製し、レトロウイルスベクター(MarX)に組み込んだ。MarXベクターは3′LTR内にKwリコンビナーゼの認識配列が挿入されており、プロウイルスとして宿主ゲノム内に組み込まれたcDNAはKwリコンビナーゼによりゲノムから選択的に切り出される。同ベクターにBaF3由来cDNAを挿入し、約130万個の独立cDNAから構成される発現ライブラリーを作製した。今後は、BaF/Kw細胞へのウイルス感染によるcDNAライブラリーの導入ならびにIL-3非依存性細胞選択の後、リコンビナーゼ発現依存的にIL-3非依存性増殖能が喪失するcDNAの選択を行う。