細胞形質を指標とした疾患関連遺伝子単離・同定法の開発

以细胞性状为指标的疾病相关基因分离和鉴定方法的开发

• 批准号: 13204002
• 负责人: 畠山 昌則
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13204002/
• 关键词: ゲノム; 発現制御; 発生・分化; 遺伝子; シグナル伝達

本研究は、増殖・分化・形態といったある特定の細胞形質発現を担う遺伝子群を(1)細胞への効率良いcDNA発現ライブラリーの導入;(2)目的とする細胞形質を獲得した細胞の選択・選別;(3)部位特異的DNAリコンビナーゼによるcDNAの染色体からの切り出し・回収;(4)回収されたcDNAの再導入による細胞の再形質転換;から構成される過程を繰り返し、目的の形質発現に関わる遺伝子群を包括的に単離するシステムを樹立することを目的とする。本研究では既に、酵母由来のKw DNAリコンビナーゼを異所性に誘導発現するIL-3依存性細胞株BaF/Kwを樹立するとともに、3'LTR内にKwリコンビナーゼの認識配列を持つMarXレトロウイルスベクターを用いcDNA発現ライブラリーを作成している。本年度は、MarX-lacZレトロウイルスをBaF/Kwに感染させた後、Kwリコンビナーゼを誘導発現させることにより染色体DNAからのlacZ遺伝子切り出しに成功した。また、レトロウイルスcDNA発現ライブラリーをBaF/Kw細胞に感染後IL-3非存在下に培養し、自律的増殖能を獲得した細胞プールを複数樹立した。Kwリコンビナーゼの誘導発現により、自律増殖能を獲得した細胞プールからのレトロウイルスベクター由来cDNA回収を進めている。一方、本システムをより一般化するため、HIV由来TATトランスダクションドメインを融合したKwリコンビナーゼを作成した。この融合蛋白がTATドメイン依存的に細胞膜ならびに核膜を自由に通過する能力を有することを確認した。組み換えTAT-Kw融合蛋白を,Kwリコンビナーゼ認識配列を有するテスト遺伝子に作用させたところ、TAT-Kwは機能的リコンビナーゼとして機能した。現在、TAT-Kwによる染色体からの遺伝子切り出しのための至適条件を検討している。

は, this study raised colonization, differentiation, and morphological と い っ た あ る specific の cells form quality 発 を now bear traces of う 伝 subgroup を (1) cell へ の sharper rate good い cDNA 発 now ラ イ ブ ラ リ ー の import; (2) Objective: とする cell cytoplasm を to obtain た cells た selection 択 · selection; (3) site-specific DNAリコ ゼによる ビナ ゼによる ゼによる ゼによるcDNA <s:1> chromosome ら ら the RNA is cut out and the result is redeveloped. (4) Repress the されたcDNA nucleus and reintroduce it into the による cell nucleus for morphoplasmic 転 exchange; か ら constitute さ れ る process を Qiao り return し, purpose の character 発 now に masato わ る but 伝 subgroup を including に 単 from す る シ ス テ ム を set す る こ と を purpose と す る. In this study, で に is に and yeast is derived from Kw DNA リ コ ン ビ ナ ー ゼ を に induced by different sex 発 now す る IL - 3 dependency cell lines BaF/Kw を set す る と と も に, 3 'LTR within に Kw リ コ ン ビ ナ ー ゼ の meet with column を hold つ MarX レ ト ロ ウ イ ル ス ベ ク タ ー を with い cDNA 発 now ラ イ ブ ラ リ ー を made し て い る. は, MarX - this year lacZ レ ト ロ ウ イ ル ス を BaF/Kw に infection さ せ た, Kw リ コ ン ビ ナ ー ゼ を induced 発 now さ せ る こ と に よ り chromosome DNA か ら の lacZ heritage 伝 son り cutting out し に successful し た. ま た, レ ト ロ ウ イ ル ス cDNA 発 now ラ イ ブ ラ リ ー を BaF に / Kw cells after infection, IL - 3 non に し, self-discipline of rights in the presence of colonization can get し を た cells プ ー ル を plural set し た. Kw リ コ ン ビ ナ ー ゼ の induced 発 now に よ り, self-discipline raised colonization can get し を た cells プ ー ル か ら の レ ト ロ ウ イ ル ス ベ ク タ ー origin cDNA back 収 を into め て い る. One party, the シ ス テ ム を よ り generalization す る た め origins, HIV TAT ト ラ ン ス ダ ク シ ョ ン ド メ イ ン を fusion し た Kw リ コ ン ビ ナ ー ゼ を made し た. こ の fusion protein が TAT ド メ イ ン dependent に membrane な ら び に nuclear membrane を free に through す る を power す る こ と を confirm し た. Group み in え を TAT - Kw fusion protein, Kw リ コ ン ビ ナ ー ゼ know a match column を す る テ ス ト heritage 伝 son に role さ せ た と こ ろ, TAT - Kw は functional リ コ ン ビ ナ ー ゼ と し て function し た. Now, the TAT-Kwによる chromosome ら ら 伝 offspring are cut out to obtain a total of ため to meet the conditions を検 to obtain a total of て る る る.

项目成果

Ashizawa, S.: "Collective Inhibition of pRB Family Proteins by Phosphorylation in Cells with p16^<INK4a> Loss or Cyclin E Overexpression"J.Biol.Chem. 276. 11362-11370 (2001)

Ashizawa, S.：“p16^<INK4a> 丢失或细胞周期蛋白 E 过表达的细胞中磷酸化对 pRB 家族蛋白的集体抑制”J.Biol.Chem。

Yamada, M.: "Role of pRB-family/E2F complex in the inhibition of IL-3-dependent lymphoid cell proliferation"Cytokine. (in press). (2002)

Yamada, M.：“pRB 家族/E2F 复合物在抑制 IL-3 依赖性淋巴细胞增殖中的作用”细胞因子。

Higashi, H.: "SHP-2 tyrosine phosphatase as an intracellular target of Helicobacter pylori CagA protein."Science. 295. 683-686 (2002)

Higashi, H.：“SHP-2 酪氨酸磷酸酶作为幽门螺杆菌 CagA 蛋白的细胞内靶标。”《科学》。

Kondo, T.: "Involvement of pRB-Related p107 Protein in the Inhibition of S-Phase Progression in Response to Genotoxic Stress"J.Biol.Chem. 276. 17559-17567 (2001)

Kondo, T.：“pRB 相关 p107 蛋白参与抑制基因毒性应激反应中的 S 期进展”J.Biol.Chem。