小麦、ジャガイモ、人参からの紫外線損傷修復光回復遺伝子のクローニング

克隆小麦、马铃薯和胡萝卜的紫外线损伤修复光恢复基因

• 批准号: 01F00345
• 负责人: 山本 和生
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01F00345/
• 关键词: 紫外線損傷; 光回復遺伝子; 可視光線; GC content; 吸収スペクトル; FAD; GST-fusion; 抗血清

紫外線損傷の光回復に関わる遺伝子を、イネ、麦、大豆、ジャガイモ、人参などの有用植物からクローニングし、光回復遺伝子を操作する事で、将来紫外線耐性の植物を作る計画をたてている。先ず手始めに、イネ光回復遺伝子のクローニングを行い、遺伝子産物のin vitroでの解析を行った。イネ光回復遺伝子の場合、大腸菌で発現させると、大腸菌の光回復欠損を相補することができた。精製した酵素はin vitroでDNA上の紫外線損傷を可視光線照射に依存して修復することができた。cDNA全長1521塩基対の前1/3のGC contentは約75%で、のこり2/3の50%と顕著な違いを示した。また、in vivoでは2種類の転写産物のあることが明らかとなった。酵素の吸収スペクトルを調べたところ、380nmと450nmに吸収を持っていた。酵素を95℃で煮沸した上清の吸収スペクトルを調べたところ、380nmと450nmに吸収を持ち、市販のFADを同じ吸収特性を示した。従って、イネ光回復酵素にはFADが光吸収物質として結合していることが明らかとなった。次にこの経験をもとに、麦、大豆、ジャガイモ、人参などから光回復遺伝子のクローニングを試み、今のところ、大豆からcDNAをクローニングすることに成功している。大豆光回復酵素はイネのそれと70%以上の相同性を持っており、500アミノ酸が作る大豆蛋白質をGST-fusionの形で大腸菌で大量発現させ、タンパク質を精製したところ、大腸菌の光回復遺伝子欠損を相補し、in vitroで紫外線損傷を修復した。現在は、酵素学的特性を明らかにするとともに、酵素に対する抗血清を作成し、これを用いて、大豆そのものから酵素を精製することを計画している。

UV damage related to photorecovery of useful plants such as wheat, soybean, ginseng, ginseng, etc., and future plans for UV resistant plants. First of all, the production of light recovery gene, the analysis of gene products in vitro In the case of light recovery, coliform bacteria appear, coliform light recovery deficiency complement each other. Refined enzymes are dependent on visible light to repair UV damage on DNA in vitro. The GC content of the first 1/3 of the 1521 bp cDNA was about 75%, and the GC content of the second 2/3 was about 50%. 2 kinds of writing products in vivo The enzyme absorbs light at 380nm and 450nm. The enzyme is boiled at 95℃ and the supernatant is absorbed at 380nm and 450nm. The absorption characteristics of the supernatant are shown. The enzyme FAD produces light absorbing substances. Next, the gene of wheat, soybean, soybean, ginseng, soybean, soybean Soybean photoreversion enzyme has more than 70% identity in production, 500 percent in acid production, GST-fusion in the form of E. coli, large production, purification, and recovery of UV damage in vitro. Now, the characteristics of enzymes are clear, and the antiserum is prepared.

项目成果

Tokuhisa Hirouchi: "Class II DNA photolyase gene from Oryza sativa ; Cloning the cDNA by dilution-amplification"Molecular and General Genetics. (in press). (2003)

Tokuhisa Hirouchi：“来自稻的 II 类 DNA 光解酶基因；通过稀释-扩增克隆 cDNA”《分子与普通遗传学》。