真核生物の複製開始前複合体(pre-RC)の試験管内再構成

真核预复制起始复合物 (pre-RC) 的体外重建

• 批准号: 01J04350
• 负责人: 高橋 直子
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J04350/
• 关键词: ORC; 染色体DNA複製; ATP結合; ATP; DNA replication

真核生物の染色体DNA複製開始因子であると考えられている蛋白質複合体、ORC(Origin Recoginition Complex)を構成する6つのサブユニットの中で、Orc1p及びOrc5pはATP結合活性を有している。Orc1pのATP結合活性については、ORCがorigin DNAに結合するのに重要であるということが示唆されているが、Orc5pのATP結合活性についてはその機能が未だ明らかになっていない。そこで私はOrc5pのWalker Aモチーフに変異を持つ出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの変異株、orc5-A株を構築し、その解析を行った。orc5-A株は温度感受性を示し、非許容温度である37℃で培養すると、2C DNAを含む細胞が蓄積した。また、この株では37℃で細胞内のORCが不安定化することがわかった。次に、orc5-A株の温度感受性に対するマルチコピーサプレッサー遺伝子としてORCを構成するサブユニットの一つであるOrc4pをコードする遺伝子ORC4を単離した。Orc4pの過剰発現によってorc5-A株の非許容温度における表現型、すなわち、2C DNAの蓄積及びORCの不安定化が相補されることを見出した。orc5-A株の温度感受性の抑圧はORC4特異的であったことから、Orc5pのATP結合活性とOrc4pとは密接に関連していると考えられた。そこで、yeast two-hybrid法により、Orc5pとOrc4pとの結合を調べたところ、Orc5ApはOrc4pとの相互作用が減弱していることがわかった。これらの結果から、Orc5pのATP結合活性は細胞内でOrc4pとの相互作用に重要であり、Orc5pとOrc4pとの相互作用がORCを安定に保つために重要であると考えられる。

Chromosomal DNA replication initiation factors in eukaryotes include protein complexes, ORC (Origin Recession Complex), Orc1p and Orc5p, and ATP binding activity. Orc1 p ATP binding activity, ORC origin DNA binding activity. The construction and analysis of mutant strains of Saccharomyces cerevisiae and orc5-A were carried out. Orc5-A strain was temperature-sensitive, incubated at 37 ℃, and 2C DNA was accumulated in cells. The ORC in the cell is unstable at 37 ℃. Orc 5-A strain is a temperature-sensitive strain. Orc 4-A strain is a temperature-sensitive strain. The phenotype, accumulation of 2C DNA and instability of ORC 5-A strain were found to complement each other. The temperature sensitivity of Orc5-A strain is related to the ATP-binding activity of Orc4p. Orc 5p and Orc 4p interact with each other and weaken the interaction. Orc5p ATP binding activity is important for the interaction of Orc4p in cells.

项目成果

Makise M, Takenaka H, Kuwae W, Takahashi N, Tsuchiya T, Mizushima T: "Kinetics of ATP binding to the origin recognition complex of Saccharomyces cerevisiae"J.Biol.Chem.. 278. 46440-46445 (2003)

Makise M、Takenaka H、Kuwae W、Takahashi N、Tsuchiya T、Mizushima T：“ATP 与酿酒酵母起源识别复合物结合的动力学”J.Biol.Chem.. 278. 46440-46445 (2003)

Takahashi N, Yamaguchi Y, Yamairi F, Makise M, Takenaka H, Tsuchiya T, Mizushima T: "Analysis on origin recognition complex containing Orc5p with defective Walker A motif"J.Biol.Chem.. 279. 8469-8477 (2004)

Takahashi N、Yamaguchi Y、Yamairi F、Makise M、Takenaka H、Tsuchiya T、Mizushima T：“含有具有缺陷 Walker A 基序的 Orc5p 的起源识别复合物的分析”J.Biol.Chem.. 279. 8469-8477 (2004)