真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズムとその破綻に起因する分子病態

真核染色体DNA复制叉的分子动力学及其破坏引起的分子病理学

• 批准号: 03F03657
• 负责人: 杉野 明雄
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F03657/
• 关键词: 出芽酵母; pre RC; DNAポリメラーゼε; Cdc45-Sld3複合体; S-Cdk; Cdc7; Dbf4; DNA unwinding; 複製開始部位

前年度までのChIP(Chromatin Immunoprecipitation)解析法を用いた我々の研究から、出芽酵母染色体DNA複製に必須なDNAポリメラーゼε複合体(Pol2-dpb2-dpb3-Dpb4)は複製開始に必須なCdc45-Sld3複合体、Dpb11-Sld2複合体、及びGINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3)複合体の機能に依存して複製開始部位(ARS)にロードされることが明らかにされている。そこで、本研究ではDNAポリメラーゼε複合体が複製フォークにおいてどちらの鎖伸長反応(Leading鎖またはLagging鎖伸長反応)に関与しているかを決定する目的で、出芽酵母粗抽出液を用いたin vitro染色体DNA複製系の構築を試みている。その過程において、粗抽出液中の蛋白濃度が極度に低下しているCdc45-Sld3複合体、GINS複合体、S-Cdk複合体(Cdc28-Cln6)の多量精製方法を確立した。そこで、2000年にSeki ＆ Difleyによって開発されたG1期に同調した出芽酵母の細胞粗抽出液を用いたin vitro preRC形成系に、これら新しく精製したCdc45-Sld3,Dpb11-Sld2,GINS, S-Cdk複合体、及び既に再構成精製されているCdc7/Dbf4キナーゼ(Ddk)を加え、複製開始部位に於けるDNA unwinding反応が起こるかどうか検討し、少なくともpreRC中のMcm2-7複合体に大きな構造変化が起きることを確認した。

Previous year's ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) analysis method and the use of いた我々の research から, budding yeast chromosome DNA replication essential なDNA ポリメラーゼε complex (Pol2-dpb2-dpb3-Dpb4) is required for replication initiation: Cdc45-Sld3 complex, Dpb11-Sld2 complex, and GINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3) The function of the complex depends on the replication start site (ARS) of the complex.そこで、This study is about DNA ポリメラーゼε complex replication フォークにおいてどちらの lock elongation reaction (Leadin glock (Lagging lock elongation reaction) and the purpose of determining the purpose of the budding yeast crude extract and the use of the budding yeast crude extract Test of construction of in vitro chromosome DNA replication system. The process has been optimized and the protein concentration in the crude extract has been extremely low. A large-scale purification method for Cdc45-Sld3 complex, GINS complex, and S-Cdk complex (Cdc28-Cln6) has been established.そこで, 2000 にSeki & Difley によって开発されたG1 synchronous した budding yeast の cell crude extract を い た in vitro preRC formation systemに、これら新しくrefinedしたCdc45-Sld3,Dpb11-Sld2,GINS, S-Cdk complex, reconstituted refined Cdc7/Dbf4 Ddk complex, and replication start site DNA Unwinding anti-reverse reaction こるかどうか検question し, 小なくともpreRCのMcm2-7 complex に大きな structural change が出きることをconfirmed した.