真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズムとその破綻に起因する分子病態

真核染色体DNA复制叉的分子动力学及其破坏引起的分子病理学

• 批准号: 03F03657
• 负责人: 杉野 明雄
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F03657/
• 关键词: 出芽酵母; pre RC; DNAポリメラーゼε; Cdc45-Sld3複合体; S-Cdk; Cdc7; Dbf4; DNA unwinding; 複製開始部位

前年度までのChIP(Chromatin Immunoprecipitation)解析法を用いた我々の研究から、出芽酵母染色体DNA複製に必須なDNAポリメラーゼε複合体(Pol2-dpb2-dpb3-Dpb4)は複製開始に必須なCdc45-Sld3複合体、Dpb11-Sld2複合体、及びGINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3)複合体の機能に依存して複製開始部位(ARS)にロードされることが明らかにされている。そこで、本研究ではDNAポリメラーゼε複合体が複製フォークにおいてどちらの鎖伸長反応(Leading鎖またはLagging鎖伸長反応)に関与しているかを決定する目的で、出芽酵母粗抽出液を用いたin vitro染色体DNA複製系の構築を試みている。その過程において、粗抽出液中の蛋白濃度が極度に低下しているCdc45-Sld3複合体、GINS複合体、S-Cdk複合体(Cdc28-Cln6)の多量精製方法を確立した。そこで、2000年にSeki ＆ Difleyによって開発されたG1期に同調した出芽酵母の細胞粗抽出液を用いたin vitro preRC形成系に、これら新しく精製したCdc45-Sld3,Dpb11-Sld2,GINS, S-Cdk複合体、及び既に再構成精製されているCdc7/Dbf4キナーゼ(Ddk)を加え、複製開始部位に於けるDNA unwinding反応が起こるかどうか検討し、少なくともpreRC中のMcm2-7複合体に大きな構造変化が起きることを確認した。

Our studies using ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) analysis methods up to the previous year reveal that the DNA polymerase ε complex (Pol2-dpb2-dpb3-Dpb4), which is essential for budding yeast chromosomal DNA replication, are loaded at the replication initiation site (ARS) depending on the function of the Cdc45-Sld3 complex, Dpb11-Sld2 complex, and GINS （SLD5-PSF1-PSF2-PSF3）复合物，这对于复制启动至关重要。因此，在这项研究中，我们试图使用粗糖酵母提取物构建体外染色体DNA复制系统，以确定复制叉中DNA聚合酶ε复合物的哪种链延伸反应（前链或滞后链或滞后链延伸反应）。在此过程中，建立了一种纯化大量Cdc45-SLD3复合物，杜松子循环复合物和S-CDK复合物（Cdc28-CLN6）的方法，这些方法在粗提取物中具有非常低的蛋白质浓度。因此，通过使用Seki＆difley开发的糖酵母的粗g1相结合的细胞提取物，在2000年开发的糖酵母，这些新纯化的cdc45-sld3，dpb11-sld2，杜松使用Seki＆Difley在2000年开发的粗糙G1相提取物以及Cdc45-SLD3，DPB11-SLD2，GINS，S-CDK复合物以及已经重新生成的纯化纯化的CDC7/DBF4激酶（DDK）是否添加了在Replind-DNA反应中发生在Replind-nustrication interiT的启动位置中，并且是否会发生在重复的情况下，并且是在重复的情况下发生的。 prerc。