真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズムとその破綻に起因する分子病態

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前年度までのChIP(Chromatin Immunoprecipitation)解析法を用いた我々の研究から、出芽酵母染色体DNA複製に必須なDNAポリメラーゼε複合体(Pol2-dpb2-dpb3-Dpb4)は複製開始に必須なCdc45-Sld3複合体、Dpb11-Sld2複合体、及びGINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3)複合体の機能に依存して複製開始部位(ARS)にロードされることが明らかにされている。そこで、本研究ではDNAポリメラーゼε複合体が複製フォークにおいてどちらの鎖伸長反応(Leading鎖またはLagging鎖伸長反応)に関与しているかを決定する目的で、出芽酵母粗抽出液を用いたin vitro染色体DNA複製系の構築を試みている。その過程において、粗抽出液中の蛋白濃度が極度に低下しているCdc45-Sld3複合体、GINS複合体、S-Cdk複合体(Cdc28-Cln6)の多量精製方法を確立した。そこで、2000年にSeki ＆ Difleyによって開発されたG1期に同調した出芽酵母の細胞粗抽出液を用いたin vitro preRC形成系に、これら新しく精製したCdc45-Sld3,Dpb11-Sld2,GINS, S-Cdk複合体、及び既に再構成精製されているCdc7/Dbf4キナーゼ(Ddk)を加え、複製開始部位に於けるDNA unwinding反応が起こるかどうか検討し、少なくともpreRC中のMcm2-7複合体に大きな構造変化が起きることを確認した。