真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズムとその破綻に起因する分子病態

真核染色体DNA复制叉的分子动力学及其破坏引起的分子病理学

• 批准号: 03F03657
• 负责人: 杉野 明雄
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F03657/
• 关键词: 出芽酵母; pre RC; DNAポリメラーゼε; Cdc45-Sld3複合体; S-Cdk; Cdc7; Dbf4; DNA unwinding; 複製開始部位

前年度までのChIP(Chromatin Immunoprecipitation)解析法を用いた我々の研究から、出芽酵母染色体DNA複製に必須なDNAポリメラーゼε複合体(Pol2-dpb2-dpb3-Dpb4)は複製開始に必須なCdc45-Sld3複合体、Dpb11-Sld2複合体、及びGINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3)複合体の機能に依存して複製開始部位(ARS)にロードされることが明らかにされている。そこで、本研究ではDNAポリメラーゼε複合体が複製フォークにおいてどちらの鎖伸長反応(Leading鎖またはLagging鎖伸長反応)に関与しているかを決定する目的で、出芽酵母粗抽出液を用いたin vitro染色体DNA複製系の構築を試みている。その過程において、粗抽出液中の蛋白濃度が極度に低下しているCdc45-Sld3複合体、GINS複合体、S-Cdk複合体(Cdc28-Cln6)の多量精製方法を確立した。そこで、2000年にSeki ＆ Difleyによって開発されたG1期に同調した出芽酵母の細胞粗抽出液を用いたin vitro preRC形成系に、これら新しく精製したCdc45-Sld3,Dpb11-Sld2,GINS, S-Cdk複合体、及び既に再構成精製されているCdc7/Dbf4キナーゼ(Ddk)を加え、複製開始部位に於けるDNA unwinding反応が起こるかどうか検討し、少なくともpreRC中のMcm2-7複合体に大きな構造変化が起きることを確認した。

In the previous year, the ChIP(Chromatin Immunoprecipitation) analysis method was used in our study. The DNA complex complex (Pol2-dpb2-dpb3-Dpb4), which is essential for DNA replication in budding yeast chromosomes, must be Cdc45-Sld3 complex, Dpb11-Sld2 complex, and GINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3) complex. In this study, we tried to construct DNA replication system by using budding yeast extract in vitro. The protein concentration in the crude extract was extremely low during the process, and a method for purification of Cdc45-Sld3 complex, GINS complex and S-Cdk complex (Cdc28-Cln6) was established. In 2000, Seki & Difley developed the G1 phase of homology of budding yeast cell extract in vitro preRC formation system, newly refined Cdc45-Sld3, Dpb11-Sld2,GINS, S-Cdk complex, and reconstituted Cdc7/Dbf4 complex (Ddk). The Mcm2 -7 complex in the preRC is confirmed by the structural transformation.