真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズムとその破綻に起因する分子病態

ChIP (Chromatin-Immunoprecipitation)解析法を用いたこれまでのわれわれの研究から、出芽酵母染色体DNA複製に必須なDNAポリメラーゼεは複製開始に必須なCdc45-Sld3複合体、Dpb11-Sld2複合体、及びGINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3ヘテロ四量体複合体)の機能に依存して複製開始部位にロードされることが明らかになっている。本研究ではDNAポリメラーゼεが複製フォークにおいてどちらの鎖伸長反応(Leading鎖またはLagging鎖伸長反応)に関与しているかを決定することを目的として、出芽酵母粗抽出液を用いたIn vitro染色体DNA複製系の構築を目指している。その過程において先ず、Cdc45-SId3蛋白複合体を出芽酵母細胞粗抽出液より精製することを試みた。粗抽出液をQ-Sepharose、Cdc45-抗体カラム、及びHydroxylapatiteカラムクロマトグラフィーにかけてCdc45-Sld3複合体を精製することが出来た。こうして精製したCdc45-Sld3複合体がS-Cdk及びCdc7/Dbf4 protein kinase存在下で、pre RC複合体に直接相互作用し、複製開始部位のDNA unwinding反応を引き起こすかどうかG1期に同調した出芽酵母細胞から調製した粗抽出液を用いたin vitro pre RC形成法(原法はSeki ＆ Diffleyによって開発されたが我々の研究室の川崎が改良した)を用いて現在検討中である。

ChIP (Chromatin-Immunoprecipitation)解析法を用いたこれまでのわれわれの研究から、出芽酵母染色体DNA複製に必須なDNAポリメラーゼεは複製開始に必須なCdc45-Sld3複合体、Dpb11-Sld2複合体、及びGINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3ヘテロ四量体複合体)の機能に依存して複製開始部位にロードされることが明らかになっている。本研究ではDNAポリメラーゼεが複製フォークにおいてどちらの鎖伸長反応(Leading鎖またはLagging鎖伸長反応)に関与しているかを決定することを目的として、出芽酵母粗抽出液を用いたIn vitro染色体DNA複製系の構築を目指している。その過程において先ず、Cdc45-SId3蛋白複合体を出芽酵母細胞粗抽出液より精製することを試みた。粗抽出液をQ-Sepharose、Cdc45-抗体カラム、及びHydroxylapatiteカラムクロマトグラフィーにかけてCdc45-Sld3複合体を精製することが出来た。こうして精製したCdc45-Sld3複合体がS-Cdk及びCdc7/Dbf4 protein kinase存在下で、pre RC複合体に直接相互作用し、複製開始部位のDNA unwinding反応を引き起こすかどうかG1期に同調した出芽酵母細胞から調製した粗抽出液を用いたin vitro pre RC形成法(原法はSeki ＆ Diffleyによって開発されたが我々の研究室の川崎が改良した)を用いて現在検討中である。