真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズムとその破綻に起因する分子病態

真核染色体DNA复制叉的分子动力学及其破坏引起的分子病理学

• 批准号: 03F00657
• 负责人: 杉野 明雄
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F00657/
• 关键词: 出芽酵母; pre RC; DNAポリメラーゼε; Cdc45-Sld3複合体; S-Cdk; Cdc7; Dbf4; DNA unwinding; 複製開始部位

ChIP (Chromatin-Immunoprecipitation)解析法を用いたこれまでのわれわれの研究から、出芽酵母染色体DNA複製に必須なDNAポリメラーゼεは複製開始に必須なCdc45-Sld3複合体、Dpb11-Sld2複合体、及びGINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3ヘテロ四量体複合体)の機能に依存して複製開始部位にロードされることが明らかになっている。本研究ではDNAポリメラーゼεが複製フォークにおいてどちらの鎖伸長反応(Leading鎖またはLagging鎖伸長反応)に関与しているかを決定することを目的として、出芽酵母粗抽出液を用いたIn vitro染色体DNA複製系の構築を目指している。その過程において先ず、Cdc45-SId3蛋白複合体を出芽酵母細胞粗抽出液より精製することを試みた。粗抽出液をQ-Sepharose、Cdc45-抗体カラム、及びHydroxylapatiteカラムクロマトグラフィーにかけてCdc45-Sld3複合体を精製することが出来た。こうして精製したCdc45-Sld3複合体がS-Cdk及びCdc7/Dbf4 protein kinase存在下で、pre RC複合体に直接相互作用し、複製開始部位のDNA unwinding反応を引き起こすかどうかG1期に同調した出芽酵母細胞から調製した粗抽出液を用いたin vitro pre RC形成法(原法はSeki ＆ Diffleyによって開発されたが我々の研究室の川崎が改良した)を用いて現在検討中である。

ChIP (Chromatin-Immunoprecipitation) analysis method was used to study the functional dependence of Cdc45-Sld3 complex, Dpb11-Sld2 complex, and GINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3 tetramer complex) on DNA replication initiation sites in budding yeast chromosomes. The purpose of this study is to determine the relationship between DNA replication and the use of budding yeast crude extract In the construction of DNA replication system in vitro. In the process, Cdc45-SId3 protein complex was purified from budding yeast cell extract. The crude extract was purified from Q-Sepharose, Cdc45-antibody, and Hydroxylapatite complex. Cdc45-Sld3 complex in the presence of S-Cdk and Cdc7/Dbf4 protein kinase, RC complex in the presence of direct interaction DNA unwinding at the start of replication was initiated in the G1 phase of homology in budding yeast cells and prepared in vitro by the method of pre-RC formation (original method Seki & Diffley).