真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズムとその破綻に起因する分子病態

真核染色体DNA复制叉的分子动力学及其破坏引起的分子病理学

• 批准号: 03F00657
• 负责人: 杉野 明雄
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F00657/
• 关键词: 出芽酵母; pre RC; DNAポリメラーゼε; Cdc45-Sld3複合体; S-Cdk; Cdc7; Dbf4; DNA unwinding; 複製開始部位

ChIP (Chromatin-Immunoprecipitation)解析法を用いたこれまでのわれわれの研究から、出芽酵母染色体DNA複製に必須なDNAポリメラーゼεは複製開始に必須なCdc45-Sld3複合体、Dpb11-Sld2複合体、及びGINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3ヘテロ四量体複合体)の機能に依存して複製開始部位にロードされることが明らかになっている。本研究ではDNAポリメラーゼεが複製フォークにおいてどちらの鎖伸長反応(Leading鎖またはLagging鎖伸長反応)に関与しているかを決定することを目的として、出芽酵母粗抽出液を用いたIn vitro染色体DNA複製系の構築を目指している。その過程において先ず、Cdc45-SId3蛋白複合体を出芽酵母細胞粗抽出液より精製することを試みた。粗抽出液をQ-Sepharose、Cdc45-抗体カラム、及びHydroxylapatiteカラムクロマトグラフィーにかけてCdc45-Sld3複合体を精製することが出来た。こうして精製したCdc45-Sld3複合体がS-Cdk及びCdc7/Dbf4 protein kinase存在下で、pre RC複合体に直接相互作用し、複製開始部位のDNA unwinding反応を引き起こすかどうかG1期に同調した出芽酵母細胞から調製した粗抽出液を用いたin vitro pre RC形成法(原法はSeki ＆ Diffleyによって開発されたが我々の研究室の川崎が改良した)を用いて現在検討中である。

先前使用碎屑（染色质 - 免疫沉淀）分析的研究表明，DNA聚合酶ε（对于糖酵母酵母染色体DNA复制至关重要）在复制起始位点上加载，这取决于Cdc45-SLD3复合物的功能，DPB11-SLD2复合物，DPB11-SLD2复合物（sld2 complect offerem offeriation）。用于复制启动。在这项研究中，我们旨在使用粗糖酵母提取物构建体外染色体DNA复制系统，以确定在复制叉中哪种链伸展反应（前导链或滞后链延伸反应）。在此过程中，首次尝试从糖酵母细胞的粗提取物中纯化Cdc45-Sid3蛋白复合物。粗提取物通过Q-Sepharose，Cdc45抗体柱和羟基磷灰石柱进行色谱仪，以净化Cdc45-SLD3复合物。 Whether the thus purified Cdc45-Sld3 complex interacts directly with the pre RC complex in the presence of S-Cdk and Cdc7/Dbf4 protein kinase and causes DNA unwinding reactions at the replication initiation site is currently under investigation using an in vitro pre RC formation method using crude extracts prepared from budding yeast cells synchronized with G1 phase (the original method was developed by Seki & Diffley but improved by川崎在我们的实验室中）。