真核生物染色体DNA複製開始反応に於けるCdc7-Dbf4リン酸化酵素の機能解析

Cdc7-Dbf4激酶在真核染色体DNA复制起始反应中的功能分析

• 批准号: 03F03364
• 负责人: 杉野 明雄
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F03364/
• 关键词: Cdc7; Dbf4 protein kinase; Mcm2蛋白; Mcm2-7蛋白複合体; pre RC複合体; mcm2-12SA; Mcm4蛋白; MALDI-Tof Mass Spectrometer; 蛋白リン酸化

Cdc7/Dbf4 protein KinaseはpreRC中のMcm2-7複合体に結合し、Mcm2-7複合体中のMcm2をリン酸化しpreRCを活性化し染色体DNA複製を開始すると考えられている。本年度は、このpreRCの中心的働きをしているMcm2-7複合体をG1またはG2/M期で同調した出芽酵母細胞粗抽出液から大量に精製する方法を確立した。この方法を用いて精製したmcm2-7複合体中の各々のMcm蛋白の比率はMcm2:Mcm3:Mcm4:Mcm5:Mcm6:Mcm7=1:1:1:1:1:1:1であることが明らかになった。更に、各Mcmの量と同じ量のTah11蛋白(Cdt1)も共精製されることが明らかになった。この精製した蛋白複合体が実際preRC形成反応に使用されるかどうかを、Seki ＆ Diffleyによって開発されたin vitro preRC形成系を用いて検証した。その結果、細胞粗抽出液中に存在しているMcm2-7蛋白複合体と同様にpreRC形成に使用される事が明らかになった。また、このようにin vitroで形成されたpreRCを回収し、これまでに精製したCdc7/db4 protein kinaseで保温すると、Mcm2,Mcm4及びMcm6がほぼ定量的にリン酸化されることを明らかにした。一方、精製したMcm2-7-Tah11 (Cdt1)とCdc7/Dbf4 protein kinaseと保温するとMcm2,Mcm4及びmcm6が部分的にリン酸化されることが明らかになった。これらの結果から、Mcm2,Mcm4,及びMcm6がCdc7/Dbf4 protein kinaseで定量的にリン酸化されるためにはARS上に形成されたpreRCに組み込まれた形のMcm2-7複合体でなければならないと考えられる。

CDC7/DBF4蛋白激酶被认为与PRERC中的MCM2-7复合物结合，MCM2-7复合物中的磷酸化MCM2，激活PRERC并开始染色体DNA复制。今年，我们建立了一种纯化MCM2-7复合物的方法，该方法是根据在G1或G2/M阶段同步的原油牺牲的酵母细胞提取物中起着核心作用的。据显示，使用此方法纯化的MCM2-7复合物中每个MCM蛋白的比率为MCM2：MCM3：MCM4：MCM5：MCM5：MCM7：MCM7 = 1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。此外，揭示了与每个MCM量相同的TAH11蛋白（CDT1）。使用Seki＆Diffley开发的体外PRERC形成系统验证了这种纯化的蛋白质复合物是否确实在PRERC形成反应中使用。结果，发现它用于PRERC形成，类似于粗细细胞提取物中存在的MCM2-7蛋白质复合物。此外，揭示了当在体外形成并用先前纯化的CDC7/DB4蛋白激酶加热时，MCM2，MCM4和MCM6几乎被定量磷酸化。另一方面，据透露，当纯化的MCM2-7-TAH11（CDT1）和CDC7/DBF4蛋白激酶保持温暖时，MCM2，MCM4和MCM6被部分磷酸化。这些结果表明，要使MCM2，MCM4和MCM6用Cdc7/DBF4蛋白激酶定量地磷酸化，必须将MCM2-7复合物集成到ARS形成的PRERC中。