真核生物染色体DNA複製開始反応に於けるCdc7-Dbf4リン酸化酵素の機能解析

Cdc7-Dbf4激酶在真核染色体DNA复制起始反应中的功能分析

• 批准号: 03F03364
• 负责人: 杉野 明雄
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F03364/
• 关键词: Cdc7; Dbf4 protein kinase; Mcm2蛋白; Mcm2-7蛋白複合体; pre RC複合体; mcm2-12SA; Mcm4蛋白; MALDI-Tof Mass Spectrometer; 蛋白リン酸化

Cdc7/Dbf4 protein KinaseはpreRC中のMcm2-7複合体に結合し、Mcm2-7複合体中のMcm2をリン酸化しpreRCを活性化し染色体DNA複製を開始すると考えられている。本年度は、このpreRCの中心的働きをしているMcm2-7複合体をG1またはG2/M期で同調した出芽酵母細胞粗抽出液から大量に精製する方法を確立した。この方法を用いて精製したmcm2-7複合体中の各々のMcm蛋白の比率はMcm2:Mcm3:Mcm4:Mcm5:Mcm6:Mcm7=1:1:1:1:1:1:1であることが明らかになった。更に、各Mcmの量と同じ量のTah11蛋白(Cdt1)も共精製されることが明らかになった。この精製した蛋白複合体が実際preRC形成反応に使用されるかどうかを、Seki ＆ Diffleyによって開発されたin vitro preRC形成系を用いて検証した。その結果、細胞粗抽出液中に存在しているMcm2-7蛋白複合体と同様にpreRC形成に使用される事が明らかになった。また、このようにin vitroで形成されたpreRCを回収し、これまでに精製したCdc7/db4 protein kinaseで保温すると、Mcm2,Mcm4及びMcm6がほぼ定量的にリン酸化されることを明らかにした。一方、精製したMcm2-7-Tah11 (Cdt1)とCdc7/Dbf4 protein kinaseと保温するとMcm2,Mcm4及びmcm6が部分的にリン酸化されることが明らかになった。これらの結果から、Mcm2,Mcm4,及びMcm6がCdc7/Dbf4 protein kinaseで定量的にリン酸化されるためにはARS上に形成されたpreRCに組み込まれた形のMcm2-7複合体でなければならないと考えられる。

Cdc7/Dbf4 protein Kinase binds to Mcm2 -7 complex in preRC, activates Mcm2 in preRC, and initiates chromosome DNA replication. This year, the method of purification of the Mcm2 -7 complex in the G1 and G2/M phases was established. The ratio of Mcm2: Mcm3: Mcm4: Mcm5: Mcm6: Mcm7 =1:1:1:1:1. In addition, the amount of each Mcm is the same as that of Tah11 protein (Cdt1). The purified protein complex was developed in vitro preRC formation using Seki & Diffley method. As a result, Mcm2 -7 protein complex was present in the crude extract of cells and was used in the formation of preRC. The protein kinase Cdc7/db4 was purified by preRC in vitro, and Mcm2, Mcm4 and Mcm6 were purified by preRC in vitro. One side, refined Mcm2 -7-Tah11 (Cdt1), Cdc7/Dbf4 protein kinase and heat preservation Mcm2, Mcm4 and mcm6 are partially acidified. The results showed that Cdc7/Dbf4 protein kinases in Mcm2, Mcm4, and Mcm6 were quantitatively acidified, and the Mcm2 -7 complex was formed in the preRC group.