真核生物染色体DNA複製開始反応に於けるCdc7-Dbf4リン酸化酵素の機能解析

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Cdc7/Dbf4 protein KinaseはpreRC中のMcm2-7複合体に結合し、Mcm2-7複合体中のMcm2をリン酸化しpreRCを活性化し染色体DNA複製を開始すると考えられている。本年度は、このpreRCの中心的働きをしているMcm2-7複合体をG1またはG2/M期で同調した出芽酵母細胞粗抽出液から大量に精製する方法を確立した。この方法を用いて精製したmcm2-7複合体中の各々のMcm蛋白の比率はMcm2:Mcm3:Mcm4:Mcm5:Mcm6:Mcm7=1:1:1:1:1:1:1であることが明らかになった。更に、各Mcmの量と同じ量のTah11蛋白(Cdt1)も共精製されることが明らかになった。この精製した蛋白複合体が実際preRC形成反応に使用されるかどうかを、Seki ＆ Diffleyによって開発されたin vitro preRC形成系を用いて検証した。その結果、細胞粗抽出液中に存在しているMcm2-7蛋白複合体と同様にpreRC形成に使用される事が明らかになった。また、このようにin vitroで形成されたpreRCを回収し、これまでに精製したCdc7/db4 protein kinaseで保温すると、Mcm2,Mcm4及びMcm6がほぼ定量的にリン酸化されることを明らかにした。一方、精製したMcm2-7-Tah11 (Cdt1)とCdc7/Dbf4 protein kinaseと保温するとMcm2,Mcm4及びmcm6が部分的にリン酸化されることが明らかになった。これらの結果から、Mcm2,Mcm4,及びMcm6がCdc7/Dbf4 protein kinaseで定量的にリン酸化されるためにはARS上に形成されたpreRCに組み込まれた形のMcm2-7複合体でなければならないと考えられる。