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FRETによる脂溶性シグナル分子レセプターと転写共役因子間クロストークの解析

FRET分析脂溶性信号分子受体与转录辅因子之间的串扰

基本信息

批准号：
13027277
负责人：
西真弓
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、内分泌撹乱物質が脂溶性シグナル分子レセプターと転写共役因子との相互作用へ及ぼす影響を、主として中枢神経細胞内においてよりダイナミックに解析するために、GFPを用いたFRET(fluorescence resonance energy transfer)利用して生細胞内でリアルタイムに追跡する系を確立することである。本年度は、estrogen receptor(ER)αおよびβ、さらにこれらと相互作用することが知られている転写共役因子のSRC-1に焦点を置き、これらの相互作用に対して内分泌撹乱物質(bisphenol A(BPA)あるいはgenistein(GEN))がどのような影響を及ぼすかを解析した。ERα-CFPあるいはERβ-CFPとSRC-1-YFPとを共発現させた場合およびERα-CFPとERβ-YFPとを共発現させた場合、アゴニストのE210^<-7>Mを投与後15〜30分から、対照のcorticosteroneの場合と比較してFRET値の上昇を認めた。ついで、ERα-CFPあるいはERβ-CFPとSRC1-YFPとの相互作用に対するBPAおよびGenの影響を調べた。BPA10^<-5>Mは両レセプターとSRC1との相互作用に対して有意な差を示さなかった。一方、Gen10^<-6>Mを投与した場合、ERαに比べてERβとSRC1との組合せで高いFRET値を示し、ratio imageからも強い相互作用が認められた。今回用いたリガンドのE2、BPA、Genの両レセプターに対する親和性に有意な差がないにもかかわらず、ERαとERβのSRC1との相互作用の強さはリガンドの種類によって異なった。このことから、xenoestrogenのERとcoactivatorとの相互作用に及ぼす効果の相違が、xenoestrogenの示す組織特異的な作用の要因の一つであると推察された。今年度は、系の立ち上げの時期であり、COS-1細胞を用いた実験が主体となったが、今後は内分泌撹乱物質が中枢神経系に及ぼす影響に焦点を置くために、中枢神経系の様々な部位の初代培養細胞を用いて実験を行っていく予定である。そして、内分泌撹乱物質がステロイドホルモンレセプターと転写共役因子との相互作用に対していかなる影響を与えるのかを、生きている細胞内でのタンパク-タンパク相互作用という形でリアルタイムに可視化することによってダイナミックに捉え、さらにこの相互作用の変化によって神経細胞の形態などがどのように変化していくのかを経時的に観察したいと考えている。

The purpose of this study was to establish a system for tracking endocrine disruptors by using FRET(fluorescence resonance energy transfer) in central nervous system cells. This year, the interaction between estrogen receptor(ER)α and β, and the interaction between estrogen receptor(ER)α and β, and the interaction between estrogen receptor (ER) α and β, and the interaction between estrogen receptor (ER) α and β, and the interaction between estrogen receptor (ER) α and β, are analyzed. ERα-CFP and ERβ-CFP and SRC-1-YFP are found in both cases, E210^ M and E210^<-7>M are found in both cases, and FRET is found in both cases. The interaction between ERα-CFP and SRC1-YFP modulates the effects of BPA and Gen BPA10^ M is the most important factor in the interaction between BPA10 <-5>^M and SRC1. A party, Gen10^<-6>M, and SRC1 are combined to form a high FRET value, ratio image, and interaction. The affinity of E2, BPA and Gen in the middle of the application is intentionally different from that in the middle of the application. The interaction between ERα and ERβ and SRC1 is different from that in the middle of the application. The interaction between ER and coactivator and the effect of xenostrogen are investigated. This year, COS-1 cells are used in the main body and in the future, endocrine disruptors are used in the central nervous system and in the primary culture cells. Endocrine-disrupting substances can be visualized in the form of endocrine disruptors, such as those found in cells, cells, However, as this interaction changes, the shape of neurons changes and changes, which can be observed and examined during the course of time.