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GFPを用いたFRETによる神経系細胞内における転写因子間相互作用の追跡

使用 GFP 通过 FRET 追踪神经系统细胞中转录因子之间的相互作用

基本信息

批准号：
11170245
负责人：
西真弓
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

ステロイドホルモンが神経系細胞の発生、分化、機能発現に際して様々な影響を及ぼすことが知られている。こうした作用の大部分は、転写制御因子であるステロイドホルモンレセプターを介した遺伝子発現制御に基づく。リガンド結合したステロイドホルモンレセブターは通常ホモダイマーを形成して基本転写装置とともに巨大な複合体を染色体上に構築するが、この際ステロイドホルモンレセプターと基本転写装置との間を介在するいわゆる転写共役因子(cofactor)の存在が必須であることがわかってきた。神経系におけるステロイドホルモン作用の解明にはステロイドホルモンレセプターおよび転写共役因子の相互作用の機構ならび゛に異なるステロイドホルモンレセプター間のヘテロダイマー形成の可能性を検索するとともに、その作用発現の場を調節する機構を細胞種特異的にダイナミックに検索していく必要がある。こうした蛋白-蛋白相互作用の解析に、近年two hybrid systemが用いられているが、疑陽性例が非常に多いなど未だ課題が山積している。本研究は、ステロイドホルモンレセプターおよび転写共役因子、あるいは異なるステロイドホルモンレセプター同士がリガンドの添加や様々な細胞外環境の変化に対して細胞内でどのような相互作用を示すのかを、蛍光のエネルギー移動(fluorescence resonance energy transfer;FRET)を利用して生細胞内でリアルタイムにイメージングして解析する系の確立を目的とした。Estrogen receptor(ER)αをCFPで、転写共役因子のSBC-1(steroid receptor coactivator1)をYFPでそれぞれ標識し、あるいはERαおよびEBβをそれぞれCFPおよびYFPで標識し、COS細胞に共発現させ、種々の薬剤を投与してその相互作用をFRETにて解析した。FRET用あるいはdonor用の蛍光フィルターセットを用いて画像を取り込み、background処理を行った後、下記の式に従って蛍光強度の比をを求め、さらにGordonらの方法(Biophys J.74:2702-13(1998))により補正してFRET値を求めた。Positive controlとしては、CFPとYFPをglycine3個でtandemに繋いだ融合タンパクを、一方、negative controlとしてはCFPおよびYFP単独を共発現させたものを用いた。Ratio=(Intensity of FRET-background)/(Intensity of CFP-background)FRET value=mean ratio(donor+acceptor)-(mean ratio(donor only))/mean ratio(donor only)その結果、ERα-CFPとSBC-1-YFPとを共発現させた場合およびERα-CFPとERβ-YFPとを共発現させた場合、アゴニストの17-β-estradiolを投与後15-30分後において、対照のcorticosteroneの場合と比較してFRET値の上昇を認めた。今後は、その他のステロイドレセプターとSRC-1との相互作用なども含めて、初代培養神経細胞を用いて観察を進める予定である。さらに、FRETのみならず、FCCS(fluorescence cross correlation spectrography)のような新しい技術も取り入れてsingle cellかつreal timeで神経系における転写因子相互作用を解析していきたいと考える。

The growth, differentiation, and functional development of ステロイドホルモンが神経 lineage cells are affected by the influence of the して様々な and the ぼすことが知られている. Most of the functions of the こうしたのは, 転WRITING control factors であるステロイドホルモンレセプターを Introduction した伝子発existing control にbaseづく.リガンド Combined したステロイドホルモンレセブターはUsual ホモダイマーを form成してBasic writing device とともに huge complex を Chromosome constructed するが、この记Structural writing device basic writing device It is necessary to write down the existence of cofactor (cofactor).神経组におけるステロイドホルモンeffectの明にはステロイドホルモンレセプターおよび転Writing the mutual interaction mechanism of the common factor The possibility of the formation of レセプターのヘテロダイマーを検SO するとともに、そのeffect発appear The regulation of the field and the mechanism of the cell species are necessary.こうしたAnalysis of protein-protein interaction, いられているが of two hybrid systems in recent years, suspected positive cases がvery に多いなど不だproject が山集している. In this study, we write the co-operation factor, The same as the other Add the change of the extracellular environment, the change of the extracellular environment, the intracellular interaction, the movement of the light, the fluorescence Resonance energy transfer; FRET) is the purpose of utilizing the intracellular energy source to analyze and establish the system. Estrogen receptor(ER)αをCFPで、SBC-1(steroid receptor coactivator1)をYFPでそれぞれLOGO、あるいはERαおよびEBβをそれぞれCFPおよYFP identification, COS cell co-expression, species interaction and FRET analysis. FRET uses あるいはdonor uses の蛍光フィルターセットを Uses いてimage をtakesり込み、background After processing the を行った, the following formula に従って荍の比ををquestめ、さらにGordonらの method (Biophys J.74:2702-13(1998)) により Correction してFRET値をquest めた. Positive controlとしては、CFPとYFPをglycine3でtandemに线いだfusionタンパクを、One party、negative controlとしてはCFPおよびYFP単多を同発成させたものを用いた. Ratio=(Intensity of FRET-background)/(Intensity of CFP-background)FRET value=mean ratio(donor+acceptor)-(mean ratio(donor only))/mean ratio(donor only)その results, ERα-CFP and SBC-1-YFP and させた cases, ERα-CFP and ERβ-YFP and とを cases, アゴニストの17-β-estradiol を 15-30 minutes after administration において, corticosterone の occasion and comparison して FRET 〤の rise を recognition めた. Future は、その他のステロイドレセプターとSRC-1とのInteraction The results of the initial culture of the cultured cells and the use of the primary cultured cells were determined by the predetermined inspection process.さらに、FRETのみならず、FCCS(fluorescence cross correlation spectrography)のような新しいTechnologyもtakeり入れてsingle cellかつreal Timeで神経组における転WRits factor interactionをanalyticsしていきたいとtestえる.