サブトラクション抗体作成法を用いたゼノパス発生関連蛋白質の網羅的解析

利用差减抗体生产法综合分析非洲爪蟾发育相关蛋白

• 批准号: 13202038
• 负责人: 佐藤 賢一
• 金额: $ 2.56万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13202038/
• 关键词: 機能ゲノミクス; プロテオミクス; 免疫サブトラクション; 受精; アフリカツメガエル; ディフェレンシャルディスプレイ; モノクローナル抗体; ラフト

当初計画年度前半は、昨年度後半より開始したモノクローナル抗体作成を引き続き行う。4月、未精製ハィブリドーマの培養上清を用いたスクリーニング。5〜6月、ハィブリドーマのクローニング。7月、腹水採取およびモノクローナル抗体の精製。8〜9月、抗体反応性ゼノパス卵蛋白質の同定と免疫組織化学的解析。年度後半は、抗体により同定された蛋白質の質量分析と遺伝子クローニングを行う。また平行して、受精関連の膜ラフト蛋白質の分子同定と特異抗体作成実験を行う。4〜6月、精製膜ラフト蛋白質の調製。7〜8月、質量分析実験及び合成ペプチド作成。9〜11月、遺伝子クローニング、培養細胞発現実験、ウサギの免疫。12〜2月、発現膜ラフト蛋白質の活性再構成実験と抗体の精製。研究成果ゼノパス受精卵特異的な反応性を示すモノクローナル抗体群を作成した。クローンの1つは、受精後の卵蛋白質と強い反応性を持つことが確認された。この抗原蛋白質は受精卵における局在性が免疫組織化学的手法により明かとなった。抗体の標的には、新規合成蛋白質のアミノ酸配列、翻訳後修飾基(リン酸基、糖鎖、ユビキチン基など)、非蛋白質性の抗原(脂質成分等)等が考えられ、現在検証中である。さらにまた、抗体クローンが別種の動物受精卵に特異的反応性を持つか、という点についてもマウスなどのモデル動物を使って検証している。この実験により、動物種を超えた共通の受精特異的抗原の存在を検討することになる。以上の結果の一部は班会議で報告したが、特許申請のため一般の公表は控えている。一方、未受精卵の膜ラフトの受精成立関連因子である蛋白質チロシンキナーゼの精製、質量分析、分子同定、細胞発現実験、及び特異抗体作成が予定通り進み、日本分子生物学会(12月、横浜)で発表した。その関連で、国際会議での口頭発表(国際プロテオミクス会議、10月、キャンベラ)や論文発表(成果公表リスト参照)を行った。

在原始计划年的上半年，将继续生产单克隆抗体，该抗体始于去年的下半年。 4月，使用培养上清液筛选未纯净的息肉瘤。从5月到六月的Hivedoma克隆。 7月，收集腹水并单克隆抗体纯化。从八月到9月，对抗体反应性爪蟾卵子蛋白的鉴定和免疫组织化学分析。在下半年，将进行抗体鉴定的蛋白质的质量分析和基因克隆。同时，进行了与受精相关的膜筏蛋白的分子鉴定，并进行了创建特定抗体的实验。从4月到6月准备纯化的膜筏蛋白。质谱实验和合成肽的产生于7月至8月进行。 9月至11月，基因克隆，培养的细胞表达实验，兔免疫。从12月到2月，表达的膜筏蛋白和抗体纯化的主动重建实验。研究结果：制备了一组单克隆抗体，表现出对爪诺氏菌受精卵的特异性反应性。施肥后，其中一个克隆被证实对卵子蛋白具有很强的反应性。通过免疫组织化学技术揭示了这种抗原蛋白在受精卵中的定位。抗体的靶标包括新型合成蛋白的氨基酸序列，翻译后修饰组（磷酸盐组，糖链，泛素基团等），非蛋白质抗原（脂质成分等），并且目前正在研究中。此外，我们还验证了使用模型动物（例如小鼠）对其他物种受精的动物卵的抗体克隆是否具有特异性反应性。该实验将研究动物种类的普通施肥特异性抗原的存在。以上一些结果在小组会议上报告了，但由于专利申请，并未公开披露。同时，纯化，质量分析，分子鉴定，细胞表达实验和蛋白酪氨酸激酶的特异性抗体产生，这是与计划进行的，这是与未施肥的膜筏的受精有关的因素，结果呈现在日本分子生物学学会（12月，约科马州）。在这方面，在国际会议（蛋白质组学国际会议，10月，堪培拉）和纸质演讲（请参阅已发布的结果列表）上进行口头演讲。

项目成果

Sato, Ken-ichi: "Hydrogen peroxide induces Src family tyrosine kinase-dependent activation of Xenopus eggs"Devlopment Growth and Differentiation. 43. 55-72 (2001)

Sato, Ken-ichi：“过氧化氢诱导爪蟾卵的 Src 家族酪氨酸激酶依赖性激活”发育、生长和分化。

Fukami, Yasuo: "Inhibition and activation of c-Src : The head and tail of a coin"Pharmacology and Therapeutics. (印刷中). (2002)

Fukami Yasuo：“c-Src 的抑制和激活：硬币的头部和尾部”药理学和治疗（印刷中）。

Sato, Ken-ichi: "Low density detergent-insoluble membrane of Xenopus eggs : Subcellular microdomain for tyrosine kinase signaling in feftilization"Development. 129(印刷中). (2002)

Sato，Ken-ichi：“非洲爪蟾卵的低密度去污剂不溶性膜：受精过程中酪氨酸激酶信号传导的亚细胞微结构域”129（出版中）。

Tokmakov, Alexander A.: "Calcium oscillations in Xenopus egg cycling extracts"Journal of Cellular Biochemistry. 82. 89-97 (2001)

Tokmakov，Alexander A.：“非洲爪蟾卵循环提取物中的钙振荡”细胞生物化学杂志。

佐藤 賢一: "新しい蛋白質研究、プロテオミクスがもたらすもの"BIONDUSTRY. 18. 52-58 (2001)

Kenichi Sato：“新的蛋白质研究，蛋白质组学带来了什么”BIONDUSTRY 18. 52-58 (2001)。