サブトラクション抗体作成法を用いたゼノパス発生関連蛋白質の網羅的解析

利用差减抗体生产法综合分析非洲爪蟾发育相关蛋白

• 批准号: 13202038
• 负责人: 佐藤 賢一
• 金额: $ 2.56万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13202038/
• 关键词: 機能ゲノミクス; プロテオミクス; 免疫サブトラクション; 受精; アフリカツメガエル; ディフェレンシャルディスプレイ; モノクローナル抗体; ラフト

当初計画年度前半は、昨年度後半より開始したモノクローナル抗体作成を引き続き行う。4月、未精製ハィブリドーマの培養上清を用いたスクリーニング。5〜6月、ハィブリドーマのクローニング。7月、腹水採取およびモノクローナル抗体の精製。8〜9月、抗体反応性ゼノパス卵蛋白質の同定と免疫組織化学的解析。年度後半は、抗体により同定された蛋白質の質量分析と遺伝子クローニングを行う。また平行して、受精関連の膜ラフト蛋白質の分子同定と特異抗体作成実験を行う。4〜6月、精製膜ラフト蛋白質の調製。7〜8月、質量分析実験及び合成ペプチド作成。9〜11月、遺伝子クローニング、培養細胞発現実験、ウサギの免疫。12〜2月、発現膜ラフト蛋白質の活性再構成実験と抗体の精製。研究成果ゼノパス受精卵特異的な反応性を示すモノクローナル抗体群を作成した。クローンの1つは、受精後の卵蛋白質と強い反応性を持つことが確認された。この抗原蛋白質は受精卵における局在性が免疫組織化学的手法により明かとなった。抗体の標的には、新規合成蛋白質のアミノ酸配列、翻訳後修飾基(リン酸基、糖鎖、ユビキチン基など)、非蛋白質性の抗原(脂質成分等)等が考えられ、現在検証中である。さらにまた、抗体クローンが別種の動物受精卵に特異的反応性を持つか、という点についてもマウスなどのモデル動物を使って検証している。この実験により、動物種を超えた共通の受精特異的抗原の存在を検討することになる。以上の結果の一部は班会議で報告したが、特許申請のため一般の公表は控えている。一方、未受精卵の膜ラフトの受精成立関連因子である蛋白質チロシンキナーゼの精製、質量分析、分子同定、細胞発現実験、及び特異抗体作成が予定通り進み、日本分子生物学会(12月、横浜)で発表した。その関連で、国際会議での口頭発表(国際プロテオミクス会議、10月、キャンベラ)や論文発表(成果公表リスト参照)を行った。

In the first half of the year of the original plan, よ, and in the second half of the year of the previous year, よ and よ began to produce たモノ, ロ, ロ, ナ, and ナ antibody lines, を, 続, 続, and う. In April, the unrefined ハィブリド ハィブリド <s:1> を culture supernatant を was used with ハィブリド たス リ リ ニ グ グ グ. From May to June, ハィブリド ハィブリド ハィブリド ロ ロ ロ ロ ニ グ グ. In July, ascites was refined with およびモノ, ロ, ナ and <s:1> antibodies. In August and September, immunohistochemical analysis of antibody-reactive 応 ゼノパス oocyte protein <s:1> isoassay と. In the second half of the year, によ, antibody によ された, された, protein <s:1>, mass analysis と, 伝, <s:1>, ロ, ニ, グを, グを and う were conducted. Experimental work on the preparation of と specific antibodies for また parallel て and fertilization-related <s:1> membrane ラフト protein <e:1> molecules を was conducted を and う were carried out. From April to June, the refined membrane ラフト protein <e:1> is prepared. From July to August, quality analysis experiments and び synthesis ペプチド were completed. From September to November, 伝 cells were cultured, ロ ロ ニ グ グ were observed, and ウサギ immunizations were obtained. From December to February, the activity of the ラフト protein <e:1> on the development membrane was reactivated to form an experimental と antibody <e:1> for refinement. Research ゼ ノ パ ス fertilized egg specific な anti 応 sex を shown す モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody group を made し た. The と ロ ロ <s:1> <s:1> <s:1> と と of the zygote protein after fertilization is strongly antigonated 応 を and holds the <s:1> とが とが confirmation された. <s:1> antigen-protein が fertilized egg における local が immunohistochemical technique によ となった Ming となった. Antibody の mark に は, new rules on synthetic protein の ア ミ ノ acid column, double modification after 訳 base (リ ン acid, sugar, lock, ユ ビ キ チ ン base な ど), non protein の antigen (lipid composition, etc.) and other が exam え ら れ, now 検 certificate in で あ る. さ ら に ま た, antibody ク ロ ー ン が other animal zygote に specific anti 応 の を hold つ か, と い う point に つ い て も マ ウ ス な ど の モ デ ル animals which を っ て 検 card し て い る. The <s:1> empirical によ of によ and the を superえ た common <s:1> insemination specific antigen <e:1> of animal species exist を検 seek する とになる とになる とになる とになる. The above <s:1> results <s:1> a で class meeting report たが たが, a franchise application ため ため, a general <s:1> public form <s:1> control えて る る. One party, the unfertilized egg の membrane ラ フ ト の fertilization was established masato even factor で あ る protein チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ の refined, with fixed quality analysis, molecular, cell 発 now be 験 and び specific antibodies made が to molecular society り into み, Japan (December, cross creek) で 発 table し た. Even で そ の masato, international conference で の oral 発 table (international プ ロ テ オ ミ ク ス meeting, in October, キ ャ ン ベ ラ) や paper 発 table (results table リ ス ト reference) line を っ た.

项目成果

Sato, Ken-ichi: "Hydrogen peroxide induces Src family tyrosine kinase-dependent activation of Xenopus eggs"Devlopment Growth and Differentiation. 43. 55-72 (2001)

Sato, Ken-ichi：“过氧化氢诱导爪蟾卵的 Src 家族酪氨酸激酶依赖性激活”发育、生长和分化。

Fukami, Yasuo: "Inhibition and activation of c-Src : The head and tail of a coin"Pharmacology and Therapeutics. (印刷中). (2002)

Fukami Yasuo：“c-Src 的抑制和激活：硬币的头部和尾部”药理学和治疗（印刷中）。

Sato, Ken-ichi: "Low density detergent-insoluble membrane of Xenopus eggs : Subcellular microdomain for tyrosine kinase signaling in feftilization"Development. 129(印刷中). (2002)

Sato，Ken-ichi：“非洲爪蟾卵的低密度去污剂不溶性膜：受精过程中酪氨酸激酶信号传导的亚细胞微结构域”129（出版中）。

Tokmakov, Alexander A.: "Calcium oscillations in Xenopus egg cycling extracts"Journal of Cellular Biochemistry. 82. 89-97 (2001)

Tokmakov，Alexander A.：“非洲爪蟾卵循环提取物中的钙振荡”细胞生物化学杂志。

佐藤 賢一: "新しい蛋白質研究、プロテオミクスがもたらすもの"BIONDUSTRY. 18. 52-58 (2001)

Kenichi Sato：“新的蛋白质研究，蛋白质组学带来了什么”BIONDUSTRY 18. 52-58 (2001)。