サブトラクション抗体作成法を用いたゼノパス発生関連蛋白質の網羅的解析

利用差减抗体生产法综合分析非洲爪蟾发育相关蛋白

• 批准号: 12202027
• 负责人: 佐藤 賢一
• 金额: --
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12202027/
• 关键词: ゲノム機能; 発生; 受精; シグナル伝達; Xenopus; 蛋白質チロシンリン酸化; 免疫サブトラクション; 試験管内再構成

私たちは最近、ゼノパス卵の受精シグナル伝達の生化学的・細胞生物学的解析を行っている。本研究では従来の研究を背景に、発生初期過程を蛋白質レベルで包括的に研究する手法の開発を目的としている。受精の細胞内シグナル伝達は新規の遺伝子発現を伴わず、卵由来の蛋白質やmRNAを中心にまかなわれるため、蛋白質分子の機能を全体的に解析する手法を確立することは重要である。今年度は、以下の2項目について検討を行った。1.受精シグナル伝達経路の再構成受精直後の生化学的・細胞学的変化(卵活性化)を指標に、ゼノパス卵の受精成立におけるSrc型チロシンキナーゼ(SFK)の機能を検討した。その結果、SFKはホスホリパーゼCgの活性化に働く卵活性化の必要因子であることや、過酸化水素がSFK活性依存的に卵活性化を起こすことを見いだした。卵蛋白質の強いチロシンリン酸化をおこす過酸化水素の実験系は、次項のサブトラクション免疫抗体作成に抗原を提供するモデル系として利用した。2.サブトラクション免疫による抗体作成受精卵特異的な発現やチロシンリン酸化を受ける蛋白質を網羅的に同定するためのモノクローナル抗体群の作成を行った。未受精卵の抽出液を免疫したマウスを免疫抑制処理し、さらに受精卵ないし過酸化水素処理卵の抽出液で追免疫した。免疫抑制はシクロホスファミドで行い、その有効性はELISA法により確認した。現在追免疫が終了し、脾臓の摘出/ハイブリドーマの樹立を行っている。追免疫による抗体価の上昇も既に確認しており、年度終わりにはクローンの選択を行う見通しである。分子基盤的な部分については一定の成果が得られ、学術論文による成果公表も行えた。抗体作成については、免疫開始が前年9月とおそく、免疫抑制作業/成否確認を必要とするなど時間のかかるスケジュールとなり、本報告が不完全である点は反省している。次年度は抗体作成を継続しながら、卵の精子受容部位(受精の場)に存在する分子群に焦点を絞った生化学的解析と特異抗体の作成に着手する。

Recently, ゼノパスの Fertilization シグナル伝达のbiochemical and cell biological analysis を行っている. This study is based on the background of the research, the initial process of development, the protein research, and the purpose of the research and techniques. The fertilized cell contains the new regulation, the remaining protein, the mRNA, and the center of the egg. It is important to analyze and analyze the overall function of protein molecules and establish the method. This year, the following 2 projects have been completed. 1. Indicators of biochemical and cytological changes (egg activation) directly after fertilization, including the reconstruction of fertilization pathways. The fertilization of the に, ゼノパス egg の established the におけるSrc type チロシンキナーゼ(SFK) のfunctional を検した.そのRESULTS, SFKはホスホリパーゼCgのActivationに働くEgg Activation Necessary Factorsであることや、Peracidified hydrogen が SFK activity depends on the に egg activation を rises こすことを见いだした. Egg protein いチロシンリンacidified をおこすoveracidified hydrogen の実験system は、subterm のThe antigens prepared by the immune antibodies of SATBIL are available for use in the laboratory of SATURA series. 2. The sterilized antibody is used to create fertilized egg-specific fertilized ovum-containing antibodies. The に同定するためのモノクローナルantibody group を行った that has been caught by the けるprotein を snare. The aspirated fluid of unfertilized eggs has been used for immunosuppressive treatment, and the aspirated fluid of fertilized eggs treated with superacidified hydrogen has been used for chasing immunity. The effectiveness of immunosuppressive drugs has been confirmed by ELISA method. Now the immunity is over, the spleen is removed, and the spleen is removed. Antibody catch-up is confirmed and the immune system is raised, and the annual end-of-year test is selected and selected. Part of the molecular basis is determined and the result is determined, and the result of the academic paper is published and published. It is necessary to prepare the antibody, start the immunization in September of the previous year, and confirm the success of the immunosuppression operation.するなど时のかかるスケジュールとなり、This report is incomplete and であるPoints は Reflection している. In the next year, we will start the production of antibodies, focus on the presence of sperm-receptive sites in eggs (fertilization sites), focus on biochemical analysis, and production of specific antibodies.

项目成果

Sato,K.-I.: "Tyrosine kinase-dependent activation of phospholipase Cγ is required for calcium transient in Xenopus egg fertiliaztion."Dev.Biol.. 224. 453-469 (2000)

Sato, K.-I.：“爪蟾卵受精过程中的钙瞬变需要磷脂酶 Cγ 的酪氨酸激酶依赖性激活。”Dev.Biol.. 224. 453-469 (2000)

Sato,K.-I.: "Adaptor protein Shc undergoes translocation and mediates up-regulation of the tyrosine kinase c-Src in EGF-stimulated A431 cells."Genes Cells. 5. 749-764 (2000)

Sato,K.-I.：“在 EGF 刺激的 A431 细胞中，接头蛋白 Shc 发生易位并介导酪氨酸激酶 c-Src 的上调。”Genes Cells。

Sato,K.-I.: "Hydrogen peroxide induces Src family tyrosine kinase-dependent activation of Xenopus eggs."Dev.Growth Differ.. 43. 55-72 (2001)

Sato,K.-I.：“过氧化氢诱导爪蟾卵的 Src 家族酪氨酸激酶依赖性激活。”Dev.Growth Differ.. 43. 55-72 (2001)

Sato,K.-I.: "Regulation of Xenopus oocyte maturation, egg fertilization and embryogenesis by protein-tyrosine phosphorylation."Curr.Top.Biochem.Res.. 2. 91-102 (2000)

Sato,K.-I.：“通过蛋白质酪氨酸磷酸化调节非洲爪蟾卵母细胞成熟、卵子受精和胚胎发生。”Curr.Top.Biochem.Res.. 2. 91-102 (2000)

Sato,K.-I.: "Fertilization signalling and protein-tyrosine kinases."Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.. 126. 129-148 (2000)

Sato,K.-I.：“受精信号传导和蛋白酪氨酸激酶。”Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.. 126. 129-148 (2000)