両生類卵の受精におけるチロシンキナーゼ―カルシウムシグナリング経路の解析

两栖类卵受精过程中酪氨酸激酶-钙信号通路分析

• 批准号: 12780556
• 负责人: 佐藤 賢一
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780556/
• 关键词: 受精; 卵活性化; 蛋白質チロシンリン酸化; シグナル伝達; Xenopus; Src; 過酸化水素; 細胞膜マイクロドメイン; Shc; ホスホリパーゼCγ

1)ツメガエル(以下、ゼノパス)卵チロシンキナーゼXykの分子生物学的解析:神戸大学バイオシグナル研究センターの吉野博士との共同により、精製したXykの質量分析実験を行った。その結果、XykはゼノパスSrc遺伝子産物(Src1、Src2)の混合物であることが明らかになった。そこで、Src1/Src2遺伝子のクローニングを行い、野生型、活性化型、及び不活性化型遺伝子の構築を完了した。さらにXykのアミノ酸配列をもとに合成したペプチドを抗原に、抗体を2種類作成した。抗体はウエスタン法、免疫沈降法の両方でXykに高い特異性と結合性を示した。今後はXykの卵細胞での過剰発現実験を基にして、受精成立におけるXykの必要十分性について検証する。2)受精依存的チロシンリン酸化の可視化:抗リン酸化チロシン抗体を使った免疫組織化学的手法により、動物極側表層の一部が受精卵におけるチロシンリン酸化の場であることを見い出した。このリン酸化反応の極性は、精子と卵の結合が動物極に限られることと一致している。このような極性をもったチロシンリン酸化は、過酸化水素処理を受けた卵でより顕著に見られた。この知見から、過酸化水素処理が卵におけるチロシンリン酸化の解析モデル系として有用であることが示された。3)受精成立に関与する細胞膜マイクロドメインの生化学的解析:ゼノパス卵より低密度界面活性剤不溶性の膜画分(LD-DIM)を調製した。LD-DIMはコレステロールやGM1ガングリオシドに富むいわゆる「ラフト」的性質を持ち、Xykを含み、受精時のチロシンリン酸化の場であることがわかった。LD-DIMからコレステロールを除去する薬剤処理を行うと受精阻害がおこった。このことは、LD-DIMの機能が受精成立に必要であることを示唆している。今後はLD-DIMの網羅的な蛋白質同定と受精シグナル伝達の再構成実験を行う。

1) ツ メ ガ エ ル (hereinafter, ゼ ノ パ ス) eggs チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ Xyk の molecular biology analysis: god opens university バ イ オ シ グ ナ ル research セ ン タ ー の yoshino Dr と の common に よ り, refined し た Xyk の quality analysis be 験 を line っ た. そ の results, Xyk は ゼ ノ パ ス Src heritage 伝 zi chan content (Src1, Src2) の mixture で あ る こ と が Ming ら か に な っ た. そ こ で, Src1 / Src2 posthumous son 伝 の ク ロ ー ニ ン グ を line い, wild type, activeness, and び not active heritage 伝 son の finished building を し た. さ ら に Xyk の ア ミ ノ acid with column を も と に synthetic し た ペ プ チ ド に を antigens, antibodies を 2 kinds made し た. Antibody ウエスタ ウエスタ method, immunodegradation method <s:1> two prescriptions でXykに high <s:1> specificity と binding ability を shows た た. Future は Xyk の egg で の before turning 発 now be 験 を base に し て founded, fertilization に お け る Xyk の is necessary sex に つ い て 検 card す る. 2) fertilization dependent チ ロ シ ン リ ン acidification の visualization: anti リ ン acidification チ ロ シ ン antibody を っ た immunohistochemical technique に よ り, animal pole side surface の a が fertilized egg に お け る チ ロ シ ン リ ン acidification の field で あ る こ と を see い out し た. こ の リ ン acidification anti 応 の は polarity, sperm と eggs の combining が animal pole に limit ら れ る こ と と consistent し て い る. こ の よ う な polarity を も っ た チ ロ シ ン リ は ン acidification, acidification of water element 処 Richard を by け た eggs で よ り sake に 顕 ら れ た. こ の knowledge か ら, acidification passes water element 処 が eggs に お け る チ ロ シ ン リ ン acidification の parsing モ デ ル department と し て useful で あ る こ と が shown さ れ た. 3) fertilization established に masato and す る membrane マ イ ク ロ ド メ イ ン の biochemistry analysis: ゼ ノ パ ス eggs よ り low density interface active tonic insoluble の membrane draw points (LD - DIM) を modulation し た. LD - DIM は コ レ ス テ ロ ー ル や this ガ ン グ リ オ シ ド に rich む い わ ゆ る "ラ フ ト" を hold ち, the properties of Xyk を み, fertilize の チ ロ シ ン リ ン acidification の field で あ る こ と が わ か っ た. LD-DIM らコレステロ らコレステロ を を を removal of する drug treatment を for うと fertilization inhibition がお がお った. <s:1> <s:1> と and LD-DIM <s:1> function が fertilization establishment に necessary である とを とを implication of て る る る. In the future, the な proteins of the <s:1> LD-DIM <s:1> net will be determined to be と fertilized シグナ 伝 伝 to <s:1> and then form experimental を lines う.

项目成果

Fukami, Yasuo: "Inhibition and activation of c-Src : The head and tail of a coin"Pharmacology and Therapeutics. (印刷中). (2002)

Fukami Yasuo：“c-Src 的抑制和激活：硬币的头部和尾部”药理学和治疗（印刷中）。

Sato,K.-I.: "Regulation of Xenopus oocyte maturation, egg fertilization and embryogenesis by protein-tyrosine phosphorylation."Curr.Top.Biochem.Res.. 2. 91-102 (2000)

Sato,K.-I.：“通过蛋白质酪氨酸磷酸化调节非洲爪蟾卵母细胞成熟、卵子受精和胚胎发生。”Curr.Top.Biochem.Res.. 2. 91-102 (2000)

Sato,K.-I.: "Fertilization signalling and protein-tyrosine kinases."Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.. 126. 129-148 (2000)

Sato,K.-I.：“受精信号传导和蛋白酪氨酸激酶。”Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.. 126. 129-148 (2000)

Tokmakov,A.A.: "Calcium oscillations in Xenopus egg cycling extracts."J.Cell.Biochem.. (印刷中).

Tokmakov, A.A.：“非洲爪蟾卵循环提取物中的钙振荡。”J.Cell.Biochem..（正在出版）。

Sato, Ken-ichi: "Hydrogen peroxide induces Src family tyrosine kinase-dependent activation of Xenopus eggs"Development Growth and Differentiation. 43. 55-72 (2001)

Sato, Ken-ichi：“过氧化氢诱导爪蟾卵的 Src 家族酪氨酸激酶依赖性激活”发育、生长和分化。