ヒト細胞染色体の機能ネットワーク構築原理の解析

人体细胞染色体功能网络构建原理解析

• 批准号: 13206053
• 负责人: 小布施 力史
• 金额: $ 3.58万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13206053/
• 关键词: ORC; プロテオーム; 染色体; 質量分析; 複合体; ゲノム; 複製; 相互作用

下記のとおり、当初計画どおりほぼ進捗した。この過程で、ORC複合体形成制御に関する新たな知見が得られた。a.PCNAをリガンドにしたカラムを用いてPCNAと相互作用する因子群の精製に成功した。また、抗ORC1抗体による免疫沈降により、ORC1とともに複合体を形成する因子の精製に成功した。b.LC/MS/MSによる微量蛋白質同定システムを立ち上げ、従来のアミノ酸シーケンス法の2桁以上の高感度で蛋白質同定が可能なレベルに到達した(本学、小笠原教授と共同)。この方法を用いて30種類以上のPCNA結合因子の候補を同定できた。また、ヒト細胞においてORC1が他のORCサブユニットと複合体を形成していることを明らかにした。c.ORC1の量、ORC複合体形成、核内局在が細胞周期で制御されていることを明らかにした。d.他のサブユニットに対する抗体をもちいて、上記a, b, cと同様の解析を行い、抗ORC1抗体を用いた結果を確認し、さらに詳細な情報を得た。e.ORC1特異的なリボザイムを細胞に導入することにより、この因子が細胞周期の進行に必須であることが示唆された。また、ORC1の発現量をコントロールできる細胞株を樹立し、ORC1の開始複合体形成に関わる機能を明らかにした。本年度の助成により、LC/MS/MSを用いて直接的にORC複合体を直接的に検証できたこと、各サブユニットの挙動について同じ実験系で解析したことによって、動物細胞におけるORC複合体の形成機序とその役割をはじめて明らかにすることができた。一方、PCNAに関する研究は歴史が長く、相互作用因子とその生物学的な意義に関する数多くの知見が蓄積している。今回の解析により、報告があるPCNA結合因子のほとんどを同定することができ、本課題の信頼性、有効性を検証できた。また、新たなPCNA結合因子の候補が同定された。

The following is a summary of the original plan. This process provides new insights into the formation and control of ORC complexes. a.PCNA interaction factor group refinement is successful in the process of PCNA interaction. The purification of ORC1 antibody complex was successful. b.LC/MS/MS micro-protein identity system is highly sensitive to protein identity at least 2 times higher than that of LC/MS/MS micro-protein identity system (jointly by Prof. Ogasawara and Prof. Ogasawara). This method can be used to determine the candidate of PCNA binding factors of more than 30 kinds. The ORC complex is formed by the first and second cells. c. ORC1 quantity, ORC complex formation, nuclear regulation in the control of cell cycle d. The results of anti-ORC1 antibody analysis were confirmed. e. ORC1-specific factors are required for cell cycle progression. ORC1 production and function related to ORC1 initiation complex formation This year, the direct ORC complex was directly identified by LC/MS/MS, and the mechanism of ORC complex formation in animal cells was analyzed. A long history of research on PCNA and the biological significance of interacting factors have accumulated a great deal of knowledge. This paper analyzes the relationship between PCNA binding factors and reliability of the subject. The candidate for the new PCNA binding factor is determined.

项目成果

Tadokoro R, Fujita M, Miura H, Shirahige K, Yoshikawa H, Tsurimoto T, Obuse C: "Scheduled conversion of replication complex architecture at replication origins of S. cerevisiae during the cell cycle"J Biol Chem.. (In Press). (2002)

Tadokoro R、Fujita M、Miura H、Shirahige K、Yoshikawa H、Tsurimoto T、Obuse C：“细胞周期期间酿酒酵母复制起点复制复合体结构的预定转换”J Biol Chem..（正在出版）。

Shikata, K., Ohta, S., Yamada, K., Obuse, C., Yoshikawa, H., Tsurimoto, T.: "The Human Homologue of Fission Yeast cdc27, p66, Is a Component of Active Human DNA Polymerase δ"J.Biochem.. 129. 699-708 (2002)

Shikata, K.、Ohta, S.、Yamada, K.、Obuse, C.、Yoshikawa, H.、Tsurimoto, T.：“裂变酵母 cdc27、p66 的人类同源物是活性人类 DNA 聚合酶 δ 的一个组成部分“生物化学杂志.. 129. 699-708 (2002)