ヒト細胞染色体の機能ネットワーク構築原理の解析

人体细胞染色体功能网络构建原理解析

• 批准号: 13206053
• 负责人: 小布施 力史
• 金额: $ 3.58万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13206053/
• 关键词: ORC; プロテオーム; 染色体; 質量分析; 複合体; ゲノム; 複製; 相互作用

下記のとおり、当初計画どおりほぼ進捗した。この過程で、ORC複合体形成制御に関する新たな知見が得られた。a.PCNAをリガンドにしたカラムを用いてPCNAと相互作用する因子群の精製に成功した。また、抗ORC1抗体による免疫沈降により、ORC1とともに複合体を形成する因子の精製に成功した。b.LC/MS/MSによる微量蛋白質同定システムを立ち上げ、従来のアミノ酸シーケンス法の2桁以上の高感度で蛋白質同定が可能なレベルに到達した(本学、小笠原教授と共同)。この方法を用いて30種類以上のPCNA結合因子の候補を同定できた。また、ヒト細胞においてORC1が他のORCサブユニットと複合体を形成していることを明らかにした。c.ORC1の量、ORC複合体形成、核内局在が細胞周期で制御されていることを明らかにした。d.他のサブユニットに対する抗体をもちいて、上記a, b, cと同様の解析を行い、抗ORC1抗体を用いた結果を確認し、さらに詳細な情報を得た。e.ORC1特異的なリボザイムを細胞に導入することにより、この因子が細胞周期の進行に必須であることが示唆された。また、ORC1の発現量をコントロールできる細胞株を樹立し、ORC1の開始複合体形成に関わる機能を明らかにした。本年度の助成により、LC/MS/MSを用いて直接的にORC複合体を直接的に検証できたこと、各サブユニットの挙動について同じ実験系で解析したことによって、動物細胞におけるORC複合体の形成機序とその役割をはじめて明らかにすることができた。一方、PCNAに関する研究は歴史が長く、相互作用因子とその生物学的な意義に関する数多くの知見が蓄積している。今回の解析により、報告があるPCNA結合因子のほとんどを同定することができ、本課題の信頼性、有効性を検証できた。また、新たなPCNA結合因子の候補が同定された。

如下所述，几乎已经按计划取得了几乎进展。在此过程中，关于ORC复合物形成的调节，获得了新知识。一个。我们成功地纯化了使用PCNA作为配体的列与PCNA相互作用的因素组。此外，通过用抗ORC1抗体进行免疫沉淀，与ORC1形成复合物的因子的纯化成功。 b。我们已经使用LC/MS/MS启动了痕量蛋白质识别系统，并达到了一个水平，该水平允许蛋白质识别，具有两个或多个数量数量的常规氨基酸测序方法（与我们的大学Ogasawara教授的合作）高敏感性。使用此方法，可以鉴定出30多个候选PCNA结合因子。还揭示了ORC1与人类细胞中其他兽人亚基形成复合物。 c。我们揭示了ORC1，ORC复合物形成和核定位的量在细胞周期中受到调节。 d。使用与其他亚基的抗体，同样的分析是在上面的A，B和C上进行的，并确认了使用抗ORC1抗体的结果，并获得了进一步的详细信息。将E.orc1特异性核酶引入细胞中表明，该因素对于细胞周期进程至关重要。此外，我们建立了一个可以控制ORC1表达水平的细胞系，并揭示了形成ORC1启动复合物的功能。今年的赠款使我们能够使用LC/MS/MS直接验证ORC复合物，并通过分析每个亚基在同一实验系统中的行为，我们能够阐明动物细胞中ORC复合物的机制和作用。另一方面，对PCNA的研究历史悠久，并且积累了有关相互作用因素及其生物学意义的丰富知识。该分析使我们能够确定大多数报告的PCNA结合因子，并验证该主题的可靠性和有效性。此外，已经确定了PCNA结合因子的新候选。