5-メチルシトシンの酸化による突然変異誘発に関する研究

5-甲基胞嘧啶氧化诱变研究

基本信息

批准号：
13214005
负责人：
紙谷浩之
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13214005/
关键词：
5-メチルシトキン活性酸素 5-フォルミルシトシン C→T変異

项目摘要

本研究は、腫瘍抑制遺伝子p53の突然変異(C→T変異)のホットスポットは、シトシンのメチル化部位としても知られているCpG部位に存在する。本研究では、このC→T変異が、5-メチルシトシンの酸化産物の一つである、5-フォルミルシトシンの生成により誘発されたものである、という作業仮説を検証することを目的とした。5-フォルミルシトシンの前駆体(5-(1,2-dihydroxyethyl)cytosine)のフォスフォロアミタイト体を数ステップにより合成した。得られたフォスフォロアミダイト体をビルディングブロックとし、DNA合成機を用いてオリゴヌクレオチドの固相合成を行った。得られた前駆体オリゴヌクレオチドを、逆相C18カラム、逆相C18 HPLC、陰イオン交換 HPLCを用いて精製した。さらに、前駆体オリゴヌクレオチドをNalO_4による酸化により5-フォルミルシトシンを含むオリゴヌクレオチドへと誘導し、逆相C18 HPLC、陰イオン交換HPLCを用いて高純度に精製した。5-フォルミルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを用いて、部位特異的に5-フォルミルシトシンを含むプラスミドDNAの構築を行った。サル由来のCOS-7細胞にトランスフェクションし、増殖したプラスミドDNAを分析した。その結果、5-フォルミルシトシンは変異誘発能が8-ヒドロキシグアニンを若干下回る程度であることが明らかになった。予想とは異なり、C→T変異以外の変異を主に誘発した。従って、CpG部位におけるC→T変異の原因は5-フォルミルシトシンではなく、他の5-メチルシトシンの酸化産物により誘発されたものであると推測された。

这项研究指出，肿瘤抑制基因p53（C→T突变）的热点存在于CpG位点，也称为胞嘧啶甲基化位点。这项研究旨在检验工作假设，即该C→T突变是由5-甲基胞嘧啶的产生诱导的，这是5-甲基环胞嘧啶的氧化产物之一。 5-甲基环胞嘧啶前体（5-（1,2-二羟基乙基）胞嘧啶）的磷氧仪形式通过多个步骤合成。将所得的磷酸磷灰石用作构建基块，并使用DNA合成器进行了寡核苷酸的固相合成。使用反向相反的C18相，相反的C18 HPLC，阴离子交换HPLC纯化所得的前体寡核苷酸。此外，通过用Nalo_4氧化诱导前体寡核苷酸诱导含5-甲基胞嘧啶的寡核苷酸，并使用反向相反的C18 HPLC和阴离子交换HPLC纯化至高纯度。使用含有5甲基环霉素的寡核苷酸构建的位点特异性构建的质粒DNA。转染猴子衍生的COS-7细胞并分析生长的质粒DNA。结果表明，5-甲状腺素的诱变能力略低于8-羟基鸟嘌呤。与预期不同，除C→T突变以外的其他突变主要诱导。因此，据推测，CpG位点C→T突变的原因不是5-甲基胞菌素，而是由其他5-甲基胞嘧啶的氧化产物诱导的。