DNAミスマッチのDNA複製酵素による伸長と熱力学的安定性についての研究

DNA复制酶对DNA错配的延伸和热力学稳定性研究

• 批准号: 06780566
• 负责人: 紙谷 浩之
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: University of Occupational and Environmental Health, Japan
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780566/
• 关键词: ミスマッチ; DNAポリメラーゼ; 伸長反応; 熱力学的安定性

最初に8-ヒドロキシグアニン(8-OHG)を含むDNA断片を高収率かつ簡便に合成可能な新規ホスホロアミダイト体を化学合成した。これをビルディングブロックとして用い、DNA自動合成機を用いて8-OHGを含むオリゴヌクレオチドを合成し、HPLCを用いて高純度に精製した。次にオリゴヌクレオチドを酵素的に連結させ、鋳型DNAを調整した。3'-末端にミスマッチを含むプライマーと鋳型DNAをアニーリングさせ、哺乳動物細胞から調整したDNAポリメラーゼαを用いて、DNA鎖伸長反応を行った。電気泳動を用いて分析したところ、G:T(鋳型:プライマー)塩基対の伸長と、配列によってはG:A(鋳型:プライマー)塩基対の伸長が観察された。一方、8-OHGの場合には、8-OHG:C、8-OHG:A(鋳型:プライマー)塩基対の伸長と、配列によっては8-OHG:T(鋳型:プライマー)塩基対の伸長が観察された。以上の結果を、同一配列を用いて測定した熱力学的安定性と比較したところ、予想とは異なり、Gの場合にも8-OHGの場合にも、DNAポリメラーゼαによる伸長と熱力学的安定性には直接的な相関関係がないことが明らかとなった。以上、本研究で得られた結果から、DNAポリメラーゼの塩基対伸長反応には、熱力学的安定性によって、一義的に決定しているのではなく、他の要因(例えば、塩基対の形やDNAポリメラーゼとの親和性)による影響が大きいことが明らかとなった。

8-OHG (8-OHG) was initially synthesized with high yields of DNA fragments, but it was possible to synthesize them chemically. DNA synthesis by 8-OHG and purification by HPLC The next step is to adjust the DNA sequence of the enzyme. 3'-terminal DNA sequence, DNA sequence, DNA sequence The elongation of the base pair is observed in the electrokinetic analysis of the G:T(type: top) and G:A(type: top). 8-OHG: C, 8-OHG: A(TYPE: $>), 8-OHG:C, 8-OHG:A(TYPE: $>), 8-OHG: T (TYPE: $>), 8-OHG: C, 8-OHG: A (TYPE: A), 8-OHG: C, 8-OHG: A (TYPE: A), 8-OHG:T(TYPE: A), 8-OHG:T(TYPE: B), 8-OHG: A ( The above results show that the thermodynamic stability of the same column is directly related to the temperature of the column. The results of this study are as follows: 1. DNA fragmentation and elongation reaction; 2. thermodynamic stability; 3. single sense determination; 4. other important factors (e.g. DNA fragmentation and affinity).