DNAミスマッチのDNA複製酵素による伸長と熱力学的安定性についての研究

DNA复制酶对DNA错配的延伸和热力学稳定性研究

• 批准号: 06780566
• 负责人: 紙谷 浩之
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: University of Occupational and Environmental Health, Japan
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780566/
• 关键词: ミスマッチ; DNAポリメラーゼ; 伸長反応; 熱力学的安定性

最初に8-ヒドロキシグアニン(8-OHG)を含むDNA断片を高収率かつ簡便に合成可能な新規ホスホロアミダイト体を化学合成した。これをビルディングブロックとして用い、DNA自動合成機を用いて8-OHGを含むオリゴヌクレオチドを合成し、HPLCを用いて高純度に精製した。次にオリゴヌクレオチドを酵素的に連結させ、鋳型DNAを調整した。3'-末端にミスマッチを含むプライマーと鋳型DNAをアニーリングさせ、哺乳動物細胞から調整したDNAポリメラーゼαを用いて、DNA鎖伸長反応を行った。電気泳動を用いて分析したところ、G:T(鋳型:プライマー)塩基対の伸長と、配列によってはG:A(鋳型:プライマー)塩基対の伸長が観察された。一方、8-OHGの場合には、8-OHG:C、8-OHG:A(鋳型:プライマー)塩基対の伸長と、配列によっては8-OHG:T(鋳型:プライマー)塩基対の伸長が観察された。以上の結果を、同一配列を用いて測定した熱力学的安定性と比較したところ、予想とは異なり、Gの場合にも8-OHGの場合にも、DNAポリメラーゼαによる伸長と熱力学的安定性には直接的な相関関係がないことが明らかとなった。以上、本研究で得られた結果から、DNAポリメラーゼの塩基対伸長反応には、熱力学的安定性によって、一義的に決定しているのではなく、他の要因(例えば、塩基対の形やDNAポリメラーゼとの親和性)による影響が大きいことが明らかとなった。

首先，化学合成了一种新型的磷酰胺形式，该形式可以高产量和方便合成含有8-羟基鸟嘌呤（8-OHG）的DNA片段。这被用作构建块，使用自动DNA合成器合成了含有8-OHG的寡核苷酸，并使用HPLC纯化至高纯度。然后将寡核苷酸酶链接起来以制备模板DNA。退火在3'-末端和模板DNA处含有不匹配的引物，并使用从哺乳动物细胞制备的DNA聚合酶α进行DNA链延伸反应。当使用电泳分析时，根据序列，观察到G：T（模板：底漆）碱基对的扩展和G：A（模板：引物）碱基对的扩展。另一方面，在8-OHG的情况下，观察到了8-OHG：C和8-OHG的碱基对的扩展：A（模板：引物）和8-OHG的碱基对的扩展，根据序列，观察到了8-OHG：T（模板：引物）的延伸。当将上述结果与使用相同序列测量的热力学稳定性进行比较时，与预测不同时，发现在G和8-OHG中，DNA聚合酶α诱导的扩展和热力学稳定性之间没有直接相关。这项研究中获得的结果表明，DNA聚合酶的碱基对扩展反应不是由热力学稳定性决定的，而是受其他因素（例如，基本对的形状和与DNA聚合酶的亲和力）的影响。