新規DNA損傷、2-ヒドロキシアデニンに対する配列依存的なヌクレオチドの取り込み---DNA複製酵素によるヌクレオチド取り込み反応のkinetics---

新型DNA损伤的序列依赖性核苷酸掺入，2-羟基腺嘌呤---DNA复制酶的核苷酸掺入反应动力学---

基本信息

批准号：
08780664
负责人：
紙谷浩之
金额：
$ 0.64万
依托单位：
University of Occupational and Environmental Health, Japan
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780664/
关键词：
2-ヒドロキシアデニン DNAポリメラーゼ配列依存性

项目摘要

最初に2-ヒドロキシアデニン(2-OH-A)を含むDNA断片を高収率かつ簡便に合成可能なホスホロアミダイト体を化学合成した。これをビルディングブロックとして用い、DNA自動合成機を用いて2-OH-Aを含むオリゴヌクレオチドを合成した。逆層HPLC、イオン交換HPLCを用いてオリゴヌクレオチドを高純度に精製した。対照として未修飾(2-OH-Aの位置にアデニンを含む)オリゴヌクレオチドを同様に合成、精製した。上記の合成オリゴヌクレオチドをDNAポリメラーゼ反応の鋳型とし、プライマーとアニーリングさせて用いた。鋳型は、2-OH-Aの前後の配列が異なる12種類を用意した。DNAポリメラーゼとしては、大腸菌由来のクレノ-断片、哺乳動物細胞由来のDNAポリメラーゼα、βを用いた。まず、反応系に1種類のヌクレオチド(dNTP)を加えて、プライマーの伸長を観察した。その結果、全体としては、クレノ-断片はdTTPとdGTPを、ポリメラーゼα、βはdTTPとdCTPを取り込んだ。また、5'TA^*A3'配列(A^*は2-OH-A)では、いずれのポリメラーゼもdTTPとdATPを取り込んだ。さらに、DNA鎖伸長反応の際に、4種類のヌクレオチドを添加し、完全鎖長に達した反応産物の塩基配列を調べたところ、上記の結果が確認された。以上の結果を踏まえて、ヌクレオチド取り込みと鎖伸長反応のkineticsを測定している。5'TA^*A3'配列を持つ鋳型DNAを用いての実験は終了しており、2-OH-Aが、ミスコードする性質を有していることが、kineticsからも裏付けられた。現在、他の配列を用いての実験を行っている。

首先，化学合成了一种能够合成含有2-羟基二腺嘌呤（2-OH-A）的DNA片段的磷氧矿产物，并具有高产量和方便的合成。这被用作构建块，使用自动DNA合成器合成了含有2-OH-A的寡核苷酸。使用反向层HPLC和离子交换HPLC将寡核苷酸纯化至高纯度。作为对照，同样合成并纯化了未修饰的寡核苷酸（位于2-OH-A位置的腺嘌呤）。上面的合成寡核苷酸用作DNA聚合酶反应的模板，并用底漆退火。在2-OH-A之前和之后，制备了12种类型的模板。作为DNA聚合酶，使用了源自哺乳动物细胞的大肠杆菌和DNA聚合酶α和β的kleno-fragments。首先，将一种类型的核苷酸（DNTP）添加到反应系统中，以观察引物的延伸。结果，总体而言，Kleno-Fragment融合了DTTP和DGTP，而聚合酶α和β融合了DTTP和DCTP。此外，在5'ta^* a3'序列中（A^*是2-OH-A），两个聚合酶都掺入了DTTP和DATP。此外，在DNA链扩展反应中添加了四种类型的核苷酸，并检查了达到全链长度的反应产物的基本序列，从而证实了上述结果。基于上述结果，测量了核苷酸摄取和链扩展反应的动力学。使用模板DNA具有5'TA^*A3'序列的实验已经完成，动力学还证实了2-OH-A具有错误编码的特性。当前，正在使用其他序列进行实验。