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新規DNA損傷、2-ヒドロキシアデニンに対する配列依存的なヌクレオチドの取り込み---DNA複製酵素によるヌクレオチド取り込み反応のkinetics---

新型DNA损伤的序列依赖性核苷酸掺入，2-羟基腺嘌呤---DNA复制酶的核苷酸掺入反应动力学---

基本信息

批准号：
08780664
负责人：
紙谷浩之
金额：
$ 0.64万
依托单位：
University of Occupational and Environmental Health, Japan
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780664/
关键词：
2-ヒドロキシアデニン DNAポリメラーゼ配列依存性

项目摘要

最初に2-ヒドロキシアデニン(2-OH-A)を含むDNA断片を高収率かつ簡便に合成可能なホスホロアミダイト体を化学合成した。これをビルディングブロックとして用い、DNA自動合成機を用いて2-OH-Aを含むオリゴヌクレオチドを合成した。逆層HPLC、イオン交換HPLCを用いてオリゴヌクレオチドを高純度に精製した。対照として未修飾(2-OH-Aの位置にアデニンを含む)オリゴヌクレオチドを同様に合成、精製した。上記の合成オリゴヌクレオチドをDNAポリメラーゼ反応の鋳型とし、プライマーとアニーリングさせて用いた。鋳型は、2-OH-Aの前後の配列が異なる12種類を用意した。DNAポリメラーゼとしては、大腸菌由来のクレノ-断片、哺乳動物細胞由来のDNAポリメラーゼα、βを用いた。まず、反応系に1種類のヌクレオチド(dNTP)を加えて、プライマーの伸長を観察した。その結果、全体としては、クレノ-断片はdTTPとdGTPを、ポリメラーゼα、βはdTTPとdCTPを取り込んだ。また、5'TA^*A3'配列(A^*は2-OH-A)では、いずれのポリメラーゼもdTTPとdATPを取り込んだ。さらに、DNA鎖伸長反応の際に、4種類のヌクレオチドを添加し、完全鎖長に達した反応産物の塩基配列を調べたところ、上記の結果が確認された。以上の結果を踏まえて、ヌクレオチド取り込みと鎖伸長反応のkineticsを測定している。5'TA^*A3'配列を持つ鋳型DNAを用いての実験は終了しており、2-OH-Aが、ミスコードする性質を有していることが、kineticsからも裏付けられた。現在、他の配列を用いての実験を行っている。

Initially, 2-hydroxy-A (2-OH-A) was synthesized with high yield and easy to synthesize. The DNA synthesis machine is used to synthesize DNA from 2-OH-A. High purity HPLC, high purity HPLC For example, if the position of 2-OH-A is not modified, the position of 2-OH-A is not modified. The above is a summary of the results of DNA sequencing. 12 different types of 2-OH-A and 2-OH-A. DNA fragmentation, DNA fragmentation. In addition, the extension of the first type of NTP (dNTP) is detected in the reverse system. The result is that the whole body is divided into two parts: dTTP and dGTP, and the whole body is divided into two parts: α and β. , 5'TA^* A3 'arrangement (A^* In addition, four kinds of DNA fragments were added to the DNA fragment, and the DNA fragment was aligned with the DNA fragment. The above results were determined by the kinetics of the elongation reaction. The 5'TA^*A3' alignment of the DNA sequence is maintained in the presence of 2-OH-A, 2-OH-A and 2-OH-A. Now, he's in the middle of a row.