新規DNA損傷、2-ヒドロキシアデニンに対する配列依存的なヌクレオチドの取り込み---DNA複製酵素によるヌクレオチド取り込み反応のkinetics---

新型DNA损伤的序列依赖性核苷酸掺入，2-羟基腺嘌呤---DNA复制酶的核苷酸掺入反应动力学---

• 批准号: 08780664
• 负责人: 紙谷 浩之
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: University of Occupational and Environmental Health, Japan
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780664/
• 关键词: 2-ヒドロキシアデニン; DNAポリメラーゼ; 配列依存性

最初に2-ヒドロキシアデニン(2-OH-A)を含むDNA断片を高収率かつ簡便に合成可能なホスホロアミダイト体を化学合成した。これをビルディングブロックとして用い、DNA自動合成機を用いて2-OH-Aを含むオリゴヌクレオチドを合成した。逆層HPLC、イオン交換HPLCを用いてオリゴヌクレオチドを高純度に精製した。対照として未修飾(2-OH-Aの位置にアデニンを含む)オリゴヌクレオチドを同様に合成、精製した。上記の合成オリゴヌクレオチドをDNAポリメラーゼ反応の鋳型とし、プライマーとアニーリングさせて用いた。鋳型は、2-OH-Aの前後の配列が異なる12種類を用意した。DNAポリメラーゼとしては、大腸菌由来のクレノ-断片、哺乳動物細胞由来のDNAポリメラーゼα、βを用いた。まず、反応系に1種類のヌクレオチド(dNTP)を加えて、プライマーの伸長を観察した。その結果、全体としては、クレノ-断片はdTTPとdGTPを、ポリメラーゼα、βはdTTPとdCTPを取り込んだ。また、5'TA^*A3'配列(A^*は2-OH-A)では、いずれのポリメラーゼもdTTPとdATPを取り込んだ。さらに、DNA鎖伸長反応の際に、4種類のヌクレオチドを添加し、完全鎖長に達した反応産物の塩基配列を調べたところ、上記の結果が確認された。以上の結果を踏まえて、ヌクレオチド取り込みと鎖伸長反応のkineticsを測定している。5'TA^*A3'配列を持つ鋳型DNAを用いての実験は終了しており、2-OH-Aが、ミスコードする性質を有していることが、kineticsからも裏付けられた。現在、他の配列を用いての実験を行っている。

Initial に 2 - ヒ ド ロ キ シ ア デ ニ ン を (2 - OH - A) containing む DNA fragment を high 収 rate か つ simple に synthesis may な ホ ス ホ ロ ア ミ ダ イ ト body を chemical synthesis し た. こ れ を ビ ル デ ィ ン グ ブ ロ ッ ク と し て in automatic synthesis machine を use い い DNA て 2 - OH - contains A を む オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を synthetic し た. Reverse-layer HPLC, <s:1> <s:1> <s:1> exchange HPLCを for を て リゴヌ リゴヌ レ レ チドを チドを high-purity に refined た た. As seaborne と し て undecorated (2 - OH - A position の に ア デ ニ ン を む) オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を with others in に synthesis, refined し た. Written の synthetic オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を DNA ポ リ メ ラ ー ゼ anti 応 の type where と し, プ ラ イ マ ー と ア ニ ー リ ン グ さ せ て in い た. Casting type が, 2-OH-A, the sequence of the preceding and following <s:1> is が different なる12 types を purpose of た. DNA ポ リ メ ラ ー ゼ と し て は, coliform origin の ク レ ノ -, mammalian cell origin の DNA fragment ポ リ メ ラ ー ゼ alpha, beta, を with い た. ま ず, anti 応 に 1 species の ヌ ク レ オ チ ド (dNTP) を え て, プ ラ イ マ ー の elongation を 観 examine し た. そ の results, all the と し て は, ク レ ノ - fragment は dTTP と dGTP を, ポ リ メ ラ ー ゼ alpha, beta, は dTTP と dCTP を take り 込 ん だ. ま た, 5 'TA ^ * A3 with column (A ^ * は 2 - OH - A) で は, い ず れ の ポ リ メ ラ ー ゼ も dTTP と dATP を take り 込 ん だ. さ ら に elongation, DNA lock against 応 の interstate に, 4 species の ヌ ク レ オ チ ド を add し, completely lock long に し た anti 応 product の salt base with column を adjustable べ た と こ ろ, written が の results さ れ た. Tread の above results を ま え て, ヌ ク レ オ チ ド take り 込 み と lock elongation anti 応 の kinetics を determination し て い る. 5 'TA ^ * A3 with column を hold つ type where DNA を with い て の be 験 は end し て お り, 2 - OH - A が, ミ ス コ ー ド す る nature を have し て い る こ と が, kinetics か ら も in pay け ら れ た. Now, he must set up を using the を て <s:1> experiment を line って る る.

项目成果

H.Kamiya&H.Kasai: "Effects of sequence contexts on misincorporation of nucleutides opposite 2-hydroxyadenine." FEBS Letters. 391巻1/2号. 113-116 (1996)

H.Kamiya&H.Kasai：“序列背景对 2-羟基腺嘌呤相反的核苷酸错误掺入的影响。”FEBS Letters 第 391 卷，第 1/2 期（1996 年）。