アミロイド前駆体蛋白(APP)の変異特異的に分泌される新規sAPPCの機能解析

淀粉样前体蛋白 (APP) 突变特异性分泌的新型 sAPPC 的功能分析

• 批准号: 13771399
• 负责人: 城谷 圭朗
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13771399/
• 关键词: アルツハイマー病; アミロイド前駆体蛋白; 老化

新規分子sAPPC(アミロイド前駆体蛋白のC末部を含む分泌型)の機能を神経細胞で解析するため、常法に従いマウス大脳皮質の初代神経細胞培養法を確立した。神経細胞特異的なMAP2抗体とアストロサイト特異的なGFAP抗体を用いた免疫細胞染色の結果95%以上が神経細胞であったことから本実験の用途に適していると判断した。そこで293細胞由来のsAPPCを含む未精製の培養上清を1/2、1/4、1/8に希釈してマウス初代神経細胞に添加後、細胞の経過観察を行った。しかしながらsAPPCを含まない対照の293細胞培養上清を添加した神経細胞でも1日後に細胞死が観察された。これより293細胞の培養上清中には神経細胞毒性を持つ因子が存在し、sAPPCの機能を調べるにはsAPPCを精製しなければならないことがわかった。精製を行うためにはヘパリンカラムが有効であることがわかっているが、ヘパリンカラムだけではsAPPαやsAPPβも共精製されるのでsAPPCのみに反応する抗体すなわちAPPの細胞内部位を認識する抗体を作成した。その結果アフィニテイー精製に使用できる抗体価の高い抗体が得られた。一方、これまでにsAPPCはスウエーデン型変異を持つAPPを安定に発現する293細胞が分泌し野生型APPからは分泌されないことを示したが、アルツハイマー病の他の変異についてもsAPPCが分泌されるかを調べた。まずロンドン型とオランダ型変異を持つAPPを安定に発現する293細胞を得た。そしてその培養上清のヘパリン沈降物をAPPのC末部の抗体でウエスタンブロットしたところ、ロンドン型とオランダ型変異からはsAPPCが分泌されないことがわかった。よってsAPPCの分泌はアルツハイマー病で見つかっている全てのAPP変異に共通の現象ではないことがわかった。

The function of the new molecule sAPPC(the C-terminal part of the precursor protein) was analyzed in neurons. More than 95% of the results of immunocyte staining with neurocyte-specific MAP2 antibody and GFAP antibody were judged to be appropriate for the purpose of neurocyte-specific MAP2 antibody and GFAP antibody The sAPPC of 293 cells contains unrefined culture supernatant 1/2, 1/4, 1/8 and is expected to be added to the primary cells and monitored by the cells. Cell culture supernatant of 293 cells was added to the culture medium and cell death was observed one day later. In the culture supernatant of 293 cells, there are neurotoxic factors, and the function of sAPPC is regulated. The purification of sAPPα and sAPPβ is carried out by the production of antibodies against sAPPC and the recognition of intracellular sites of sAPP. The results of the study were as follows: On the one hand, sAPPC is stable due to changes in the sAPPC type, and 293 cells secrete wild-type APP instead of wild-type APP. This shows that sAPPC is secreted due to other changes in Altosha disease. 293 cells were found in stable APP The antibody of APP in culture supernatant is secreted by different types of APP All APPs are common phenomena.