一細胞RT-PCRと無細胞タンパク質合成系による抗体分子スクリーニングシステムの構築

利用单细胞RT-PCR和无细胞蛋白合成系统构建抗体分子筛选系统

基本信息

  • 批准号:
    02F00507
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.02万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for JSPS Fellows
  • 财政年份:
    2002
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2002 至 2004
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

本研究は一個の細胞由来のmRNAからRT-PCRにより抗体をコードするDNA断片だけを増幅し、無細胞タンパク質合成系により発現させるシステムの構築を目指している。すなわちチューブ内だけの連続した反応で抗体遺伝子(cDNA)を増幅し、抗原と結合する活性を持つ抗体分子(ここではFab断片)を無細胞タンパク質合成系で発現させ、ハイスループットにスクリーニングする新規なシステムの開発を目的としている。本研究実施の結果、以下の結果が得られた。1.抗体遺伝子のハイブリドーマ細胞からのRT-PCRによる増幅条件の検討抗体遺伝子は免疫細胞の成熟過程で遺伝子の再構成が起っており、複数のプライマーセットを用いる必要がある。また極微量の鋳型からのPCRの場合、プライマーダイマーや、ターゲット以外の配列にミスアニールすることによる、目的産物以外の増幅が顕著である。そこでまずハイブリドーマを用いて、一細胞由来mRNAからの増幅を検討した。この際副産物の増幅を押さえるのに有効なsingle primerによる増幅反応を試みた。なお用いるプライマーの配列はKabatの抗体データベースを参考に設計した。2.一細胞RT-PCRによる増幅条件の検討マウスの脾臓から、抗CD19抗体結合マグネットビーズにより抗体を産生しているB細胞を精製し、それを用いて様々な一細胞RT-PCRの増幅条件を試みた。例えば、細胞の培養日数、RTの条件、PCRのサイクル数など。細胞を培養し、3日目と4日目の場合には、増殖されたサンプルの数が多かった。最終的に、最適化的な1細胞RT-PCR増幅条件を確立した。そして、確立した増幅条件を利用し、非免疫マウスの一個B細胞から抗体L鎖を増幅させることを試みた。IgBLAST databaseおよびGENETYX-MACにより、増幅されたサンプルのシークエンスの解析を行った。その結果、得られた遺伝子は新規マウスL鎖遺伝子であった。3.マウスからの抗体の取得あらかじめ抗原を免疫したマウスの脾臓から、抗CD19抗体結合マグネットビーズにより抗体を産生しているB細胞を回収・精製した。確立した反応条件でそのB細胞を鋳型とした一細胞RT-PCRを行った。増幅した遺伝子に、無細胞タンパク質合成系での発現に必要なRNAポリメラーゼのプロモーター配列などをオーバーラップPCRにより付加し、無細胞タンパク質合成系の鋳型としてFabを発現させた。合成されたFabが抗原認識活性をELISA法により調べた。その中で活性が最も高かったFabのH鎖とL鎖のシークエンスの解析を行い、新しい抗体遺伝子が得られたことを確認した。
This study aims to construct a cell-derived mRNA sequence, an antibody sequence, a DNA fragment sequence, and a cell-free plasmid synthesis system. The antibody gene (cDNA) is amplified, the antigen binds, the activity of the antibody molecule (Fab fragment) is maintained, and the cell-free plasmid synthesis system is developed. The results of this study are summarized as follows. 1. RT-PCR amplification conditions for antibody gene expression and maturation of immune cells; gene recombination; and multiple PCR amplification. In the case of PCR, the amount of fine particles is reduced, and the amount of particles is increased except for the target product A cell derived mRNA is used to detect and detect the presence of the gene. The amplitude of the by-product is increased. Kabat's Antibody Design Reference 2. A cell RT-PCR amplification condition was used to study the amplification of anti-CD19 antibody binding to B cells, purification of anti-CD19 antibody binding to B cells and amplification of anti-CD19 antibody binding to B cells. Example, number of days of cell culture, RT conditions, PCR number. The number of cells cultured on the 3rd and 4th day was increased. The final and optimized RT-PCR amplification conditions for concretely 1 cells were established. A B-cell antibody is used to increase the amplitude of the antibody. IgBLAST database and GENETYX-MAC analysis The result is that the new rules are not applicable. 3. Anti-CD19 antibody production and purification To establish the reverse transcription conditions for B cell DNA typing, a cell RT-PCR was performed The development of a cell-free DNA synthesis system requires RNA sequencing and PCR amplification. Synthesis of Fab Antigen Recognition Activity ELISA The highest activity of Fab and L was detected in the analysis of Fab and L.

项目成果

期刊论文数量(1)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Hideo Nakano, Tsuneo Yamane: "in Vitro Expression of Proteins with Disulfide Bridges and its Application for a High-Throughput Screening System(ed.by J.R.Swartz)""Cell-Free Protein Expression",Springer. 8 (2003)
Hideo Nakano、Tsuneo Yamane:“二硫键蛋白质的体外表达及其在高通量筛选系统中的应用(J.R.Swartz 编)”“无细胞蛋白质表达”,Springer。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
{{ item.title }}
{{ item.translation_title }}
  • DOI:
    {{ item.doi }}
  • 发表时间:
    {{ item.publish_year }}
  • 期刊:
  • 影响因子:
    {{ item.factor }}
  • 作者:
    {{ item.authors }}
  • 通讯作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ journalArticles.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ monograph.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ sciAawards.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ conferencePapers.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ patent.updateTime }}

山根 恒夫其他文献

山根 恒夫的其他文献

{{ item.title }}
{{ item.translation_title }}
  • DOI:
    {{ item.doi }}
  • 发表时间:
    {{ item.publish_year }}
  • 期刊:
  • 影响因子:
    {{ item.factor }}
  • 作者:
    {{ item.authors }}
  • 通讯作者:
    {{ item.author }}

{{ truncateString('山根 恒夫', 18)}}的其他基金

一細胞RT-PCRと無細胞タンパク質合成系による抗体分子スクリーニングシステムの構築
利用单细胞RT-PCR和无细胞蛋白合成系统构建抗体分子筛选系统
  • 批准号:
    02F02507
  • 财政年份:
    2004
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for JSPS Fellows
mRNAのリボゾーム複合体へのバイオターゲティング
mRNA 生物靶向核糖体复合物
  • 批准号:
    11132225
  • 财政年份:
    1999
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
mRNAのリボゾーム複合体へのバイオターゲティング-効率的な無細胞遺伝子翻訳反応をめざして-
mRNA 生物靶向核糖体复合物 - 旨在实现高效的无细胞基因翻译反应 -
  • 批准号:
    10145221
  • 财政年份:
    1998
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
リパーゼおよびリパーゼ関与反応の生物工学的研究
脂肪酶和脂肪酶相关反应的生物技术研究
  • 批准号:
    97F00393
  • 财政年份:
    1998
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for JSPS Fellows
リパーゼによる油脂加水分解用膜型バイオリアクターの反応工学的解析
脂肪酶膜生物反应器水解油脂反应工程分析
  • 批准号:
    57550601
  • 财政年份:
    1982
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
固定化酵素懸濁液への酸素吸収
固定化酶悬浮液中的氧气吸收
  • 批准号:
    X00210----375507
  • 财政年份:
    1978
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)

相似国自然基金

Fab糖基化IgG促进巨噬细胞IL-10表达在乳腺癌微环境中的作用研究
  • 批准号:
  • 批准年份:
    2024
  • 资助金额:
    15.0 万元
  • 项目类别:
    省市级项目
油桐FAB2和SCD协同酰基-ACP硫酯酶促进α-桐酸形成的分子机理研究
  • 批准号:
    2023JJ30992
  • 批准年份:
    2023
  • 资助金额:
    0.0 万元
  • 项目类别:
    省市级项目
Fab糖基化IgG调节巨噬细胞极化在乳腺癌生长转移中的作用机制研究
  • 批准号:
  • 批准年份:
    2021
  • 资助金额:
    10.0 万元
  • 项目类别:
    省市级项目
AT-Hook转录因子AHL23调节花生油酸合成基因FAB2表达的分子机制研究
  • 批准号:
    2020A1515010022
  • 批准年份:
    2020
  • 资助金额:
    10.0 万元
  • 项目类别:
    省市级项目
基于抗体Fab片段特异性识别核酸适配体的人源抗dsDNA抗体精准富集与定量策略研究
  • 批准号:
    2020A1515010668
  • 批准年份:
    2020
  • 资助金额:
    10.0 万元
  • 项目类别:
    省市级项目
基于分子印迹识别的 Fab 小分子抗体分离新方法研究
  • 批准号:
    21808150
  • 批准年份:
    2018
  • 资助金额:
    25.0 万元
  • 项目类别:
    青年科学基金项目
Anti-CD26Fab-miR-29b-金纳米复合物抑制皮肤创口愈合过程中胶原合成的实验研究
  • 批准号:
    81700947
  • 批准年份:
    2017
  • 资助金额:
    20.0 万元
  • 项目类别:
    青年科学基金项目
基于抗体Fab片段特异性识别多肽配基的体内Infliximab精准富集策略研究
  • 批准号:
    81703460
  • 批准年份:
    2017
  • 资助金额:
    20.1 万元
  • 项目类别:
    青年科学基金项目
基于定向固定抗体Fab片段的免疫层析技术同时检测中药中多种真菌毒素的研究
  • 批准号:
    81660660
  • 批准年份:
    2016
  • 资助金额:
    38.0 万元
  • 项目类别:
    地区科学基金项目
甲型肝炎病毒与中和性抗体可变区Fab复合物的三维结构和免疫原性研究
  • 批准号:
    31570717
  • 批准年份:
    2015
  • 资助金额:
    60.0 万元
  • 项目类别:
    面上项目

相似海外基金

FuSe-TG: FAB: A Heterogeneous Ferroelectronics Platform for Accelerating Big Data Analytics
FuSe-TG:FAB:加速大数据分析的异构铁电子平台
  • 批准号:
    2235366
  • 财政年份:
    2023
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Standard Grant
ACED Fab: Ultrafast, low-power AI chip with a new class of MRAM for learning and inference at edge
ACED Fab:超快、低功耗 AI 芯片,配备新型 MRAM,用于边缘学习和推理
  • 批准号:
    2314591
  • 财政年份:
    2023
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Standard Grant
ACED Fab: Runtime Reconfigurable Array (RTRA) Technology for AI/ML
ACED Fab:适用于 AI/ML 的运行时可重构阵列 (RTRA) 技术
  • 批准号:
    2315295
  • 财政年份:
    2023
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Standard Grant
ACED Fab: 240-GHz Energy-Efficient CMOS MIMO Radar
ACED Fab:240GHz 节能 CMOS MIMO 雷达
  • 批准号:
    2314969
  • 财政年份:
    2023
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Standard Grant
Advanced Thin Film Sputtering Fabrication Facility (TF-FAB)
先进薄膜溅射制造设备 (TF-FAB)
  • 批准号:
    EP/X030202/1
  • 财政年份:
    2023
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Research Grant
ACED Fab: On-chip CMOS-MEMS Infrared Spectroscopy Systems
ACED Fab:片上 CMOS-MEMS 红外光谱系统
  • 批准号:
    2314932
  • 财政年份:
    2023
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Standard Grant
FAB (Fast, Affordable, Better care)
FAB(快速、实惠、更好的护理)
  • 批准号:
    10082878
  • 财政年份:
    2023
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Collaborative R&D
ACED Fab: Co-Design of Novel Electronic-Photonic Systems for Energy-Efficient Coherent Optical Interconnects
ACED Fab:用于节能相干光互连的新型电子-光子系统的协同设计
  • 批准号:
    2314868
  • 财政年份:
    2023
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Standard Grant
Fluid channel Array Brick (FAB) Blood-Gas Exchangers for building Artificial Lungs for Critical Respiratory Failure Treatment
用于构建人工肺以治疗危重呼吸衰竭的流体通道阵列砖 (FAB) 血气交换器
  • 批准号:
    10668676
  • 财政年份:
    2022
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
FAB - Targeting cell senescence to treat chronic wounds
FAB - 靶向细胞衰老治疗慢性伤口
  • 批准号:
    10025899
  • 财政年份:
    2022
  • 资助金额:
    $ 1.02万
  • 项目类别:
    Collaborative R&D
{{ showInfoDetail.title }}

作者:{{ showInfoDetail.author }}

知道了