遺伝子組み換えバベシア原虫の作製法の確立とその応用

转基因巴贝斯虫原虫生产方法的建立及其应用

• 批准号: 13760204
• 负责人: 横山 直明
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760204/
• 关键词: バベシア原虫; transfer vector; GRA1 promoter; Pyrimethamine; エレクトロポレーション法; 遺伝子導入; EGFP; TgDHFR-Ts; 遺伝子組み換え原虫; promoter; 薬剤; エレクトロポレーション; DHFR

本研究の目的は、バベシア原虫体内に異種の標的遺伝子を含む発現カセットを導入し、それらを原虫遺伝子内に組み込ませることで目的の蛋白質を恒常的に発現しうる遺伝子組み換え原虫の作製法を確立することにあった。まず、真核細胞用CAG promoter、Toxoplasma gondiiのGRA1 promoter、もしくはBabesia bovisのRAP-1 promoterを上流に添えたenhanced green fluorescent protein (EGFP:蛍光発色蛋白質)発現カセットを含む3種類のtransfer vectorを構築し、エレクトロポレーション法によりBabesia bovis虫体内に遺伝子の導入を試みた。その結果、T. gondiiのGRA1 Promoter付きEGFP vectorを導入したバベシア原虫のみ、明瞭な蛍光色を細胞質内から発する陽性像を観察した。しかしながら、そのような陽性原虫の出現率は約0.01%と低く、また遺伝子導入後4日目にはその陽性蛍光像が完全に消失してしまったことから、更なる改良が必要とされた(Fujii et al.,J. Protozool. Res.投稿中)。次に、薬剤耐性遺伝子として知られるTgDHFR-Ts遺伝子を活用して遺伝子導入原虫を選抜し、陽性原虫の回収効率を向上させる試みを行った。そこではまず、TgDHFR-Ts蛋白質が耐性能を示す薬剤Pyrimethamineのバベシア原虫に対する増殖阻害効果が調べられた。その結果、IC_<50>、0.8-3.2μg/mlでPyrimethamineがパペシア原虫の試験管内増殖を有意に抑えることが示された(Nagai et al.,Antimocrob. Agents chemother.,2003)。そのため、Pyrimethamine耐性TgDHFR-Ts遺伝子及びEGFP遺伝子を共発現できる新たなTransfer vectorを構築し、Pyrimethamine選択下でのEGFP遺伝子発現B. bovis原虫の出現率及びその発現性状を現在検討している。以上の成果から、1)エレクトロポレーション法によりTransfer vectorを原虫内に導入できること、2)T. gondiiのGRA1 promoterによって外来遺伝子をバベシア原虫体内で発現させることができること、3)一過性ではあるが、外来遺伝子EGFPをバベシア原虫体内で発現できること、4)Pyrimethamineがバベシア原虫の増殖抑制効果を示すこと、が明らかとなった。TgDHFR-Ts遺伝子を用いた遺伝子導入バベシア原虫の回収効率の向上に向けた研究は現在もなお進行中である。

The purpose of this study is to introduce the heterogeneous target of the protozoa into the body, and to introduce the heterogeneous target into the protozoa. The production method of the group is changed and the original protein is produced.まず, CAG promoter for eukaryotic cells, Toxoplasma gondii のGRA1 promoter, もしくはBabesia bovis のRAP-1 promoter を上流にTim えたenhanced green fluorescent protein (EGFP: 荍光発色protein) 発现カセットをcontains 3 types of transfer vector constructionし, EGFPクトロポレーション法によりBabesia The introduction of the remaining parts of the body of the bovis insect is the test.その results, T. gondii のGRA1 Promoter pay きEGFP vector したバベシアprotozoa のみ, clear な蛍光色をpositive image in the cytoplasm から発する. The occurrence rate of positive protozoa of しかしながら and そのような is about 0.01% and is as low as 4 days after the introduction of また缝子.はそのpositive light image がcompletely disappeared してしまったことから、More improvements are necessary とされた(Fujii et al., J. Protozool. Res. under submission). Second, the resistance of TgDHFR-Ts has been improved, and the recovery efficiency of positive protozoa has been improved. The resistance properties of TgDHFR-Ts protein and TgDHFR-Ts protein show the resistance of Pyrimethamine and the protozoa's proliferation-inhibiting effect.その results, IC_<50>, 0.8-3.2μg/ml Pyrimethamine がパペシア protozoa の tube propagation を intentional に suppress え る こ と が Show さ れ た (Nagai et al., Antimocrob. Agents chemother., 2003).そのため, Pyrimethamine-resistant TgDHFR-Ts 伝子 and びEGFP 伝子 を同発appears できる新たなTransfer vector をconstruct し, Pyrimethamine selection 択下でのEGFP 伝子発appears B. The occurrence rate of protozoa bovis and the current characteristics of the protozoa are now discussed. The above results are as follows: 1) The transfer vector of the エレクトロポレーション method is introduced into the protozoa できること, 2) T. gondii GRA1 Promoter によってExotic legacy をバベシアProtozoa で発appears in the body させることができること, 3) Transient ではあるが, Foreign legacy 伝子EGFPをバベシアThe protozoa has a で発appearance in the body, and 4) Pyrimethamine has a protozoan reproduction-inhibiting effect. The recovery efficiency of TgDHFR-Ts protozoa has been introduced into the protozoa using the same method, and research on the recovery efficiency is currently underway.

项目成果

Boonchit, S. et al.: "Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay with recombinant rhoptry-associated protein 1 antigen against Babesia bovis for the detection of specific antibodies in cattle"Journal of Clinical Microbiology. 40・10. 3771-3775 (200

Boonchit, S. 等人：“用重组棒状体相关蛋白 1 抗原检测牛特异性抗体的酶联免疫吸附测定的评估”临床微生物学杂志 40・10。 200

Nagai, A. et al.: "Growth-Inhibitory Effects of Artesunate, Pyrimethamine, and Pamaquine against Babesia equi and Babesia caballi in In Vitro Cultures"Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47・2. 800-803 (2003)

Nagai, A. 等人：“青蒿琥酯、乙胺嘧啶和帕马喹对体外培养的马巴贝虫和马巴贝虫的生长抑制作用”抗菌剂和化疗 47·2 (2003)。

Hirata, H. et al.: "Identification of a Specific Antigenic Region of the P82 Protein of Babesia equi and Its Potential Use in Serndiagnosis"Journal of Clinical Microbiology. 41・2. 547-551 (2003)

Hirata, H.等人：“马巴贝斯虫P82蛋白的特定抗原区域的鉴定及其在诊断中的潜在用途”临床微生物学杂志41・2（2003）。

Nishisaka, M., Yokoyama, N. et al.: "Characterisation of the gene encoding a protective antigen from Babesia microti identified it a eta subunit of chaperonin containing T-complex protein 1"International Journal of Parasitology. 31. 1673-1679 (2001)

Nishisaka, M.、Yokoyama, N. 等人：“编码来自田鼠巴贝虫的保护性抗原的基因的表征鉴定出它是含有 T 复合体蛋白 1 的伴侣蛋白 eta 亚基”《国际寄生虫学杂志》。

Yakoyama, N. et al.: "Roles of the Maltese cross form in the development of parasitemia and protection against Babesia microti infection in mice"Infection and Immunity. 71・1. 411-417 (2003)

Yakoyama, N. 等人：“马耳他十字形在小鼠寄生虫血症的发生和预防巴贝虫感染中的作用”感染和免疫 71·1 (2003)。