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非機能であるエンドセリン受容体の変異遺伝子を用いた心不全の遺伝子治療法の開発

利用非功能性内皮素受体突变基因开发心力衰竭基因疗法

基本信息

批准号：
14770308
负责人：
酒井俊
金额：
$ 2.37万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトエンドセリン(ET)受容体は、7回膜貫通型のG蛋白共役受容体であり、7個の細胞膜貫通ドメインと3個の細胞内ループを有する。N末端から数えて第7膜貫通ドメインには、NPXXYというプロリン残基を有する配列をもつ。この配列はG蛋白共役受容体一般に共通であり、受容体が正常に機能するために必須の配列であり、この部位の遺伝子変異はその受容体機能を発揮できないことが知られている。本年度は以下の研究を行った。1.ヒトETA受容体遺伝子のクローニングおよび変異ETA受容体遺伝子の作製とベクター作製HEK293細胞から抽出したtotal RNAから逆転写反応を行い、cDNAライブラリーを作製した。Web上に公開されている塩基配列をもとにPCRプライマーを作製し、ヒトETA受容体遺伝子をクローニングし、後の実験のために、EGFP配列を結合させた(hETA-EGFP)。この配列のPro残基にmutationを加え、変異ETA受容体遺伝子を作製した(mu-hETA-EGFP)。後の動物個体への遺伝子導入を目的として、作製したETA受容体およびその変異遺伝子をアデノウイルスベクターとその前段階のシャトルベクターに組み込んだ。2.ヒトETB受容体遺伝子のクローニングおよび変異ETB受容体遺伝子の作製とベクター作製同様の手法を用いて、ヒトETB受容体遺伝子についてもクローニングおよび変異ETB受容体遺伝子(hETB-EGFP, mu-hETB-EGFP)作製を行い、それを組み込んだベクターを作製した。3.作製した受容体の細胞における発現の確認COS-7細胞へ、シャトルベクターに組み込んだ各受容体および変異受容体をトランスフェクションし、蛍光顕微鏡および抗EGFP抗体を用いたウェスタンブロットにより、各遺伝子が蛋白レベルで発現していることを確認した。

The receptor for G protein is 7 membrane-penetrating receptors, 7 membrane-penetrating receptors and 3 intracellular receptors. The N-terminal residues are aligned with the 7th membrane penetration residues. This sequence is common to G protein co-receptor, and the receptor is required for normal function. This sequence is different from the receptor function. This year, the following research was conducted. 1. ETA receptor gene production and control HEK293 cells total RNA production and control cDNA production. Web site open to the public in the middle of the base alignment, PCR, EGFP alignment, control, ETA receptor gene, EGFP alignment, after the end of the integration (hETA-EGFP). Mutation of Pro residues in this sequence is added to and modified by ETA receptor gene (mu-hETA-EGFP). After the introduction of individual animal genes, the target and control of ETA receptor and its variant genes were determined. 2. ETB receptor gene production and production of different ETB receptor gene production and production of the same method, ETB receptor gene production and production of different ETB receptor gene (hETB-EGFP, mu-hETB-EGFP) production and production of different ETB receptor gene. 3. COS-7 cells were identified for the development of receptor cells and for the development of receptor proteins. The cells were identified for each receptor and each heteroreceptor by microscopy and anti-EGFP antibodies.