非機能であるエンドセリン受容体の変異遺伝子を用いた心不全の遺伝子治療法の開発

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ヒトエンドセリン(ET)受容体は、7回膜貫通型のG蛋白共役受容体であり、7個の細胞膜貫通ドメインと3個の細胞内ループを有する。N末端から数えて第7膜貫通ドメインには、NPXXYというプロリン残基を有する配列をもつ。この配列はG蛋白共役受容体一般に共通であり、受容体が正常に機能するために必須の配列であり、この部位の遺伝子変異はその受容体機能を発揮できないことが知られている。本年度は以下の研究を行った。1.ヒトETA受容体遺伝子のクローニングおよび変異ETA受容体遺伝子の作製とベクター作製HEK293細胞から抽出したtotal RNAから逆転写反応を行い、cDNAライブラリーを作製した。Web上に公開されている塩基配列をもとにPCRプライマーを作製し、ヒトETA受容体遺伝子をクローニングし、後の実験のために、EGFP配列を結合させた(hETA-EGFP)。この配列のPro残基にmutationを加え、変異ETA受容体遺伝子を作製した(mu-hETA-EGFP)。後の動物個体への遺伝子導入を目的として、作製したETA受容体およびその変異遺伝子をアデノウイルスベクターとその前段階のシャトルベクターに組み込んだ。2.ヒトETB受容体遺伝子のクローニングおよび変異ETB受容体遺伝子の作製とベクター作製同様の手法を用いて、ヒトETB受容体遺伝子についてもクローニングおよび変異ETB受容体遺伝子(hETB-EGFP, mu-hETB-EGFP)作製を行い、それを組み込んだベクターを作製した。3.作製した受容体の細胞における発現の確認COS-7細胞へ、シャトルベクターに組み込んだ各受容体および変異受容体をトランスフェクションし、蛍光顕微鏡および抗EGFP抗体を用いたウェスタンブロットにより、各遺伝子が蛋白レベルで発現していることを確認した。